[发明专利]β-葡聚糖酶活力的测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种测定β-葡聚糖酶活力的方法，具体涉及用MBTH法测定β-葡聚糖酶活力的方法尤其涉及测定过程中关键参数的选择。

背景技术

β-葡聚糖是一类非淀粉类多糖，它是由β-1，3-葡萄糖苷键和/或β-1，4-葡萄糖苷键组成的链状多糖，是植物细胞壁的组成成分，存在于禾谷类(包括大麦、燕麦、黑麦和小麦等)的糊粉层和胚乳细胞壁中。β-葡聚糖酶对β-葡聚糖中的糖苷键具有重要的水解作用。目前，该酶已广泛用于啤酒、饲料、纺织、造纸、医药等行业。该酶活力的检测方法有粘度法、荧光法、显色底物法、凝胶扩散法、还原糖测定法等，其中最常采用的方法为还原糖测定法中的DNS法、铁氰化钾法和Somogyi-nelson法。由于这三种方法灵敏度较低，很难测到酶解反应的初速度，因此，准确度较差。

本发明以MBTH(3-甲基-2-苯并噻唑酮腙)试剂为显色剂来测β-葡聚糖酶的活力。该法不受低浓度醋酸盐和丁二酸盐缓冲液的干扰，所得酶浓度曲线与酶解反应速度在较宽的酶浓度范围内呈线性相关。

发明内容

针对已有技术的不足，本发明提供一种β-葡聚糖酶活力的测定方法，该方法采用3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH)法来测定β-葡聚糖酶的活力。

以下详细介绍本发明一种β-葡聚糖酶活力的测定方法，A，制作用MBTH法测得的葡萄糖吸光度值与其相应浓度的标准对应关系曲线；B，用MBTH法检测待测β-葡聚糖酶水解β-葡聚糖后产生的相当于葡萄糖的吸光度值；根据上一步骤制作的葡萄糖浓度与测得的相应吸光度值之间的标准对应关系曲线确定待测β-葡聚糖酶的酶解产物中在单位时间内所产生的相当于葡萄糖的还原糖的含量，以此来推算β-葡聚糖酶的活力。

优化地；上述步骤A的具体步骤是；作用MBTH法测得的葡萄糖吸光度值与其相应浓度标准对应关系曲线；分别取6-15组不同浓度(0-30μg/mL)的葡萄糖标准溶液0.6mL，加入0.6mL 0.5当量的NaOH溶液，混匀，再加入MBTH试剂0.6mL于75-85℃水浴加热5-20min后趁热加入硫酸铁铵试剂1.2mL，室温冷却后于波长620-680nm处测定葡萄糖的吸光度值；每个浓度做三个平行样；以上加量可按比例增减；根据每组葡萄糖浓度与测得的相应吸光度值之间的关系绘制标准对应关系曲线；

优化地；上述步骤B的具体步骤是；用MBTH法检测β-葡聚糖酶的活力；将浓度为1-5mg/mL的预热至测定温度的β-葡聚糖溶液，加入至预热至测定温度的β-葡聚糖酶溶液中进行酶解反应，测定温度为25-40℃，水解时间为60min以内，取水解液迅速与等体积的0.5当量的NaOH溶液充分混匀以终止反应(可在反应过程中分时间段取样检测)，取1.2mL加入到试管中(做三个平行样)，再加入MBTH试剂0.6mL于75-85℃水浴加热5-20min后趁热加入硫酸铁铵试剂1.2mL，室温冷却后于波长620-680nm处测定吸光度值，以上加量可按比例增减。根据上一步骤制作的葡萄糖的浓度与测得的相应吸光度值之间的标准对应关系曲线确定待测β-葡聚糖酶的活力；β-葡聚糖酶的活力单位可被定义为在上述条件下，每毫升反应体系中，每分钟产生1nmol相当于葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。其中MBTH试剂的制法是3mg/mL的3-甲基-2-苯并噻唑酮腙溶液和1mg/mL的二硫苏糖醇溶液等体积混合即得，现用现配，一天内有效。

优化地；上述硫酸铁铵试剂的制法是0.5％(FeNH₄(SO₄)₂)·12H₂O，0.5％氨基磺酸，0.5当量盐酸。

优化地；上述β-葡聚糖以50mM的丁二酸缓冲溶液或醋酸缓冲溶液为溶剂。

优化地；上述测定吸光度值的最佳波长为650nm。

本发明的优点是本发明用MBTH法对β-葡聚糖酶水解β-葡聚糖后所产生的葡萄糖端基的数量进行检测以此来确定β-葡聚糖酶的活力；葡萄糖以及低聚β-葡聚糖是β-葡聚糖酶水解的产物，因此对葡萄糖端基含量检测的灵敏度直接决定着对β-葡聚糖酶活力检测的灵敏度。该方法比比浊法简便、快速、准确、价廉。检测限和工作浓度范围都明显低于DNS法和铁氰化钾法，所以本方法的灵敏度明显高于DNS法和铁氰化钾法。

具体实施方式

实施例1：