[发明专利]苏木素在检测免疫效应细胞介导的细胞毒效应中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及苏木素在检测免疫效应细胞介导的细胞毒效应中的应用。

背景技术

NK、CTL和DC等免疫效应细胞具有重要的抗肿瘤作用。随着肿瘤免疫学研究的深入进展， 显示细胞介导的细胞毒效应测定方法应运而生，为肿瘤生物治疗的基础和临床研究奠定了基 础。目前，检测细胞介导的细胞毒效应方法较多，基本可分为同位素法和非同位素法两类。 同位素法包括4h⁵¹Cr释放法和³H-TdR掺入法。这两种方法虽然敏感、特异，但前者存在半衰 期短、自然释放率高等问题，后者则需要复杂的仪器设备，同时二者均可造成环境污染，使 其应用受到限制。非同位素法包括流式细胞分析(FACS)法、乳酸脱氢酶法、微量NAG释放 法、结晶紫染色法和克隆形成法等，诸多方法均有不尽人意之处，例如FACS法特异、敏感， 但需要大型仪器设备和配套试剂，不适合基层推广应用。MTT比色法敏感、简便、无环境污 染，不需复杂仪器设备，近年来通过对各种实验条件的不断完善，一直用于细胞增殖活性和 细胞毒效应测定。各种NK细胞系的相继建立为进一步研究NK细胞的功能提供了良好的模型。 然而NK细胞系一般来源于恶性肿瘤，具有倍增周期短、代谢率高等生物学特性，在采用MTT 比色法检测该类细胞介导的细胞毒效应时，重复性较差的情况时有发生，基于此，建立稳定、 特异、简便、经济的检测细胞介导的细胞毒效应的方法具有重要的应用价值。

苏木素是一种天然染料，通过氧化变为苏木红，通常用于生物组织切片细胞核的染色。 目前尚无将苏木素染色法用于测定细胞介导的细胞毒效应测定的相关研究报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种利用苏木素检测免疫效应细胞介导的细胞毒效应 的测定方法，也是苏木素的一种新用途。

具体应用时，方法如下：将贴壁肿瘤细胞悬液置于细胞培养板中，贴壁后，加入待测免 疫效应细胞，构成一定的效靶比，于培养箱中共孵育适当时间后，取出，弃上清，用PBS洗 板3次(以去除效应细胞)后，立即加入4％多聚甲醛固定30分钟，然后加入苏木素染色液， 100μl/孔，染色20分钟后，蒸馏水洗3～5次(以去除未结合的染料)，室温晾干；加入1％ 的盐酸酒精脱色，100μl/孔，脱色后立即用酶标仪测定540nm处的吸光度值并记录，计算各 效靶比的杀伤率，公式如下：

其中，OD(E)表示效应细胞(E)孔OD值，OD(T)表示靶细胞(T)孔OD值，OD(E+T)表示效应 细胞(E)+靶细胞(T)孔OD值。

在加入苏木素染色液前，用4％的多聚甲醛固定待测细胞液(效应细胞已被洗去，主要用 来固定靶细胞，但也有部分未洗去的效应细胞被固定)，固定30分钟。

所述苏木素染色液是按文献【《常用苏木素几种配方与染色结果的比较》(李文，张赛霞， 解剖学杂志，2000；23(4)：393)】中的描述配制的，方法如下所示：1.5g苏木素用5ml无 水乙醇溶解，蒸馏水溶解钾明矾(加温至90℃，勿煮沸)，将溶解的苏木素和碘酸钠同时加入 钾明矾水溶液内，流水冷却至室温，再加甘油，震荡1小时后即可使用，染液可保用6个月。

所述1％盐酸酒精溶液是指盐酸和酒精体积分数分别为1％和70％的溶液。

所述PBS是指0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，PH＝7.2。

所述4％的多聚甲醛溶液是按照【文献《组织培养和细胞学技术》(鄂征，北京出版社 P146)】中的描述配制的，方法如下：将多聚甲醛40g溶于0.1mol PBS 1000ml中，加热至60 ℃左右，不断搅拌至透明，也可加少许1molNaOH使溶液透明。

本方法的基本原理如下：苏木素染色法利于立即固定的细胞着色，而固定前早已死亡或 自溶的细胞及碎片不能吸附染料，所以细胞必须进行固定后方可进行苏木素染色。在测定OD 值之前，用1％盐酸酒精将吸附在细胞核上的染料溶解，此时各孔中液体呈现粉红色。选择 540nm波长立即进行测定，活细胞数量越多，细胞状况越好，则染色越深，所测OD值越高， 反之，活细胞越少，状况越差，则染色越浅，OD值越低，从而对活细胞进行定量。