[发明专利]斑节对虾杆状病毒现场快速高灵敏检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及海洋生物病原检测技术，具体是斑节对虾杆状病毒(Monodon Baculovirus，简称MBV)的现场快速高灵敏检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

斑节对虾杆状病毒，又名草虾杆状病毒(Grass Shrimp Baculovirus)、斑节对虾型杆状病毒(Penaeusmonodon-type Baculovirus)，是一种双链DNA杆状病毒，MBV可以感染斑节对虾(Penaeus monodon)、长毛对虾(P.penicillatus)、墨吉对虾(P.merguiensis)、短沟对虾(P.semisulcatus)、新对虾等多种养殖及野生对虾。该病毒严重感染时可导致对虾幼体大量死亡，使对虾育苗及养殖遭受经济损失，影响水产养殖业的稳定和可持续发展。所以开发新的技术快速、准确、灵敏地检测MBV，加强对虾苗种和成虾检疫以及养殖水体环境的监测，对预防病毒感染，切断病毒传播，保障我国对虾养殖业的健康持续发展具有重要意义。

目前，有关MBV检测还主要依赖于病理切片法、电镜观察法和PCR检测法。病理切片法不能直接对病毒进行检测，只能利用发病的组织病理征兆进行检测，并且还局限于在实验室内进行；电子显微镜技术虽然可以直接观察到病毒粒子的存在，但其操作复杂、耗费时间长、准确性低；用抗体检测法检测MBV虽然在速度上优于病理切片法，但其灵敏度较低，在MBV尚未引发感染或感染的极早期很难用抗体法检测出来；MBV的PCR检测法，虽然克服了前面几种方法的缺点，在实验室条件下能实现对MBV的相对快速、准确检测，但由于常规的PCR检测需要昂贵的PCR仪、凝胶电泳和成像系统，使得PCR检测法难以用于现场的快速检测，这大大限制了PCR检测方法在现场生产中的推广应用。

发明内容

本发明的目的是要提供一种适于生产现场应用、快速、高灵敏度且易操作的斑节对虾杆状病毒检测方法，并将检测方法标准化，同时将检测试剂集中于规范的试剂盒中，以克服现有技术的不足，使MBV的检测更准确、灵敏、快速、安全和方便。

首先，本发明利用针对MBV多角蛋白基因中保守区段设计的4条特异引物和一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒定温度下对目的核酸进行扩增，实现对MBV的快速和高灵敏检测。为了进一步缩短检测时间、消除检测过程中可能发生的污染、简化检测步骤，使检测实验能够在生产现场开展，本发明对MBV的实验室检测方法进行了优化。在用FTA卡片制备样品核酸的标准步骤中，需要将被样品匀浆液润湿的FTA膜片在室温下干燥至少一个小时，然后才能进行漂洗；本发明通过在被样品匀浆液润湿的FTA膜片上滴加亲水性且易挥发的醇类物质(主要是叔醇、伯醇和仲醇)，使润湿的FTA膜片在室温条件下只需10分钟即可完成干燥过程，大大缩短了样品核酸制备的时间。在利用等温扩增方法检测病原时，目前普遍采用扩增反应结束后向反应管中添加核酸染料以判断检测结果的方法；由于等温扩增反应的产物量非常大，这种打开反应管再添加核酸染料的方法极易导致后续待检样品被污染而使检测结果出现假阳性；有报道和专利采用在扩增反应试剂中添加尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)的方法消除污染风险，但却增加了成本；本发明先将核酸染料粘附到扩增反应管的内侧上方或盖子内侧，等扩增反应结束后再通过上下反复震荡使扩增反应液和核酸染料混合，这样不打开扩增反应管就能完成扩增产物的染色，消除了打开扩增反应管再添加核酸染料过程中反应液可能溅出造成后续样品被污染的风险。在用FTA卡片制备样品核酸的标准步骤中，需要用Whatman公司(英国)专门的纯化试剂反复漂洗FTA膜片；本发明无需专门的纯化试剂，采用普通的蒸馏水漂洗即可完成FTA膜片的纯化，这样不仅简化了检测实验的操作步骤，还降低了成本。为了使该方祛在生产现场更具实用性，本发明在上述优化的基础上，将检测MBV病毒所需的试剂与器材进行了组装，使之标准化、配套化，形成了检测试剂盒。

本发明的检测试剂盒包括：

(1)采样管，用来盛放、研磨待检样品；

(2)漂洗管，内装蒸馏水；

(3)核酸变性管，内装TE缓冲液；