[发明专利]一种携带人乳铁蛋白重组腺病毒及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种携带人乳铁蛋白重组腺病毒，其特征在于，该腺病毒携带乳铁蛋 白hLTF基因和绿色荧光蛋白GFP基因。

2.制备权利要求1所述的携带人乳铁蛋白重组腺病毒的方法，其特征在 于，具体包括下列步骤：

(一)重组人乳铁蛋白腺病毒质粒载体的构建

1)人乳铁蛋白基因及绿色荧光蛋白基因的扩增克隆

根据GENBANK中人乳铁蛋白基因序列设计一对引物扩增hLTF基因，所述 引物序列如下：

上游引物P15′-tcggtaccGACATGAAACTTGTCTTCC-3′；

下游引物P25′-cgctcgagTTACTTCCTGAGGAATTC-3′；

PCR产物整合到pcDNA3.1质粒

绿色荧光蛋白基因的引物如下：

上游引物：P35′-tttaagcttACCATGGTGAGCAAGGGCGAG-3′，

下游引物：P45′-cccgatatcTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3′

以Takara公司pEGFP-N1载体为模板，扩增包含GFP基因PCR的产物用 HindIII和EcoRV酶切；纯化，PCR产物被整合到Invictogen公司的pcDNA3.1 载体相应的区域命名为p3LTF；p3LTF经NotI和PmeI双酶切，获得GFP基因被 连接到pIRES质粒；生成的质粒命名为pIR-G；p3LTF经NheI和XhoI双酶切， 得到hLTF的cDNA，将其整合到pIR-G生成的质粒命名为pLTF-GFP；

2)含hLTF和GFP基因的重组穿梭载体的构建

用NheI/NotI酶将LTF-GFP基因片段切出纯化后，克隆入腺病毒穿梭载体 pShuttle-CMV载体，获得含有hLTF和GFP的重组穿梭载体pShuttle-GFP-hLTF；

3)重组腺病毒质粒载体的构建

将重组穿梭载体pShuttle-GFP-hLTF转化到含腺病毒骨架载体AdEasy的 BJ5183感受态细胞中，在大肠杆菌重组酶的作用下穿梭载体与腺病毒骨架载体 间发生同源重组，将外源基因转入腺病毒骨架载体，经氨苄和酶切鉴定筛选获 得了含有外源基因的重组腺病毒质粒pAdCMV-GFP-hLTF；

4)重组腺病毒的获得

将重组腺病毒质粒pAdCMV-GFP-hLTF用核酸限制性内切酶PacI酶切线性化 后经脂质体lipofectamine 2000^TM介导转染293细胞包装成Ad-hLTF；

(二)重组人乳铁蛋白腺病毒的扩增

将293细胞接种于平皿中，待细胞生长到90％汇合状态时，按10个空斑形 成单位/细胞的量加入病毒，36～48小时后，细胞出现完全病变效应，收集细胞 并冻存于-70℃，累计到50～60个平皿时，统一纯化病毒；

(三)重组人乳铁蛋白腺病毒的纯化

1)将出现病变效应的293细胞于-80℃和37℃间反复冻融三次，2500转/ 分离心10分钟，去除细胞碎片；

2)依次将0.5ml的1.5g/ml氯化铯溶液、2.5ml的1.35g/ml氯化铯溶 液和2.5ml的1.25g/ml氯化铯溶液加入超速离心机中，将6ml待纯化病毒上 清加于各管氯化铯梯度液之上；10℃下35000转/分离心1h，收集1.35g/mlCsCl 溶液和1.25g/ml氯化铯溶液间出现白色雾状病毒带；

3)将病毒带与1.35g/ml氯化铯溶液混合，10℃下35000转/分离心18小 时，吸出病毒带，以1～2倍的Hanks液稀释病毒；

4)以Hanks液为透析液4℃透析病毒，每2h更换一次透析液，共换液5次， 取出纯化的病毒液；

5)空斑实验确定其滴度分别为重组人乳铁蛋白腺病毒Ad-hLTF为1×10¹⁰pfu/ml；重组绿色荧光蛋白腺病毒Ad-GFP为5×10¹⁰pfu/ml；

6)加10％无菌甘油，-80℃冻存。

3.权利要求1所述的携带人乳铁蛋白重组腺病毒在制药中的应用。