[发明专利]一种携带人乳铁蛋白重组腺病毒及其制备方法和应用

说明书

技术领域：

本发明属于细胞生物学和基因工程技术领域，涉及一种治疗宫颈癌实体瘤 的药物及用药方法，该种药物通过操作手段所获得。

背景技术：

宫颈癌是妇科广发恶性肿瘤，由于阴道细胞学检查的广泛应用，其发病率 在世界各地明显下降，但在发展中国家仍居妇科恶性肿瘤的首位。我国对宫颈 癌的防治也已取得很大成效，但在一些地区随着人乳头瘤病毒(HPV)感染率的上 升和社会生活的改变，宫颈癌的发病率有升高趋势，尤其在近20年来发病明显 趋于年轻化，且宫颈腺癌比例增加，鳞、腺癌之比由过去的10:1降低到现在 的4:1。上述变化对宫颈癌治疗方案的选择有很大影响，由于年轻患者的增多， 治疗后对生活质量的要求提高，对保留卵巢和阴道功能的要求尤为突出。因此， 对宫颈癌的诊治提出了新问题，对传统的“放疗为主，早期手术，化疗毋庸” 的宫颈癌治疗模式提出了质疑。尤其近20年来提倡的新辅助化疗为要求保留卵 巢和阴道功能的青年和部分中年患者提供了宝贵的手术机会。但是，腺癌易早 期发生淋巴结的转移，对放疗的敏感性较差，对化疗容易产生耐药性，一次治 疗难度加大，预后不理想。因此，寻找一种科学、可行的途径来治疗宫颈癌、 改善预后成为宫颈癌治疗领域的热点问题。

人乳铁蛋白(human lactoferrin，hLF)是一种隶属于铁结合蛋白家族的糖 基化蛋白，具有广谱抗菌、免疫调节、抗氧化、抗炎症、抗病毒和抗肿瘤等生物 学功能。乳铁蛋白是体内的一种蛋白，对结肠癌、口腔癌、头颈癌及实体瘤上 均表现出明显的抑制作用，且对机体无毒副作用，应用前景非常广阔。

经检索，未发现以腺病毒为载体介导人乳铁蛋白基因药物经瘤周注射用药， 治疗宫颈癌和调节机体免疫力的研究。

发明内容

针对现有技术中存在的问题与不足，本发明的目的在于提供一种携带人乳 铁蛋白重组腺病毒，该腺病毒携带乳铁蛋白hLTF基因和绿色荧光蛋白GFP基因。 经过瘤周注射可作为一种基因工程药物用于临床实体型宫颈癌的治疗。

所述基因工程药物携带人乳铁蛋白重组腺病毒属于复制缺陷型病毒，即不 能在靶细胞内自主复制，可以表达外源人乳铁蛋白基因。

本发明的另一个目的是提供上述携带人乳铁蛋白重组腺病毒的制备方法， 具体包括下列步骤：

(一)重组人乳铁蛋白腺病毒质粒载体的构建

1.人乳铁蛋白基因及绿色荧光蛋白基因的扩增克隆

(1)根据GENBANK中人乳铁蛋白基因序列设计一对引物扩增hLTF基因， 在引物的5’端分别含限制性内切酶KpnI和XhoI(划线的部分)的酶切位点， 所述引物序列如下：

上游引物P1 5′-tcggtaccGACATGAAACTTGTCTTCC-3′；

下游引物P2 5′-cgctcgagTTACTTCCTGAGGAATTC-3′；

PCR产物整合到pcDNA3.1(+)质粒(Invitrogen)

(2)绿色荧光蛋白基因的引物如下，在引物的5’端分别含限制性内切酶 HindIII和EcoRV(划线部分)的酶切位点

上游引物：P3 5′-tttaagcttACCATGGTGAGCAAGGGCGAG-3′，

下游引物：P4 5′-cccgatatcTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3′

以pEGFP-N1载体(Takara)为模板，扩增包含GFP基因PCR的产物用HindIII 和EcoRV酶切。纯化，PCR产物被整合到pcDNA3.1(+)载体相应的区域命名为 p3LTF。p3LTF经NotI和PmeI双酶切，获得GFP基因被连接到pIRES质粒 (Takara)。生成的质粒命名为pIR-G(6820bp)。p3LTF经NheI和XhoI双酶 切，得到hLTF的cDNA，将其整合到pIR-G生成的质粒命名为pLTF-GFP。

2.含hLTF和GFP基因的重组穿梭载体的构建

用NheI/NotI酶将LTF-GFP基因片段切出纯化后，克隆入腺病毒穿梭载体 pShuttle-CMV载体，获得含有hLTF和GFP的重组穿梭载体pShuttle-GFP-hLTF。