[发明专利]一种转化体及基于其制备重组人降钙素基因相关肽的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物制药领域，涉及人降钙素基因相关肽(CGRP)重组质粒的构建、转化体的构建，融合蛋白的表达以及目的蛋白的纯化，特别涉及一种基于转化体制备重组人降钙素基因相关肽的方法。 

背景技术

降钙素基因相关肽(Cacitonin Gene-Related Peptide，简称CGRP)是1983年Rosenfeld等应用分子生物技术发现的一种生物活性多肽，是由37个氨基酸组成：Ala-Cys-Asp-Thr-Ala-Thr-Cys-Val-Thr-His-Arg-Leu-Ala-Gly-Leu-Leu-Ser-Arg-Gly-Gly-Val-Val-Lys-Asn-Asn-Phe-Val-Pro-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Lys-Ala-Phe-NH₂。CGRP与降钙素来自一个共同的由2800个碱基对组成基因，其中含有5个内含子和6个外显子。该基因在不同的组织中进行基因重组：在甲状旁腺可以转录、表达成降钙素，而在神经系统可以转录、表达成CGRP。人的CGRP有α和β两种分子型式，其氨基酸的组成和排列基本相同，仅在第3、22、25为的氨基酸不同：α型为Asp、Val和Asn，β型为Asn、Met和Ser；CGRP的基因亦有α和β两种，分别表达α和β型的CGRP，均为单拷贝基因，定位在第11号染色体的短臂上。CGRP的mRNA最先翻译成分子量为16000Da、由128个氨基酸组成的CGRP前体，存贮于分泌颗粒内，释放时酶解成CGRP发挥其生物学作用。 

CGRP是人体内由感觉神经末梢释放的一种重要的神经血管调节肽，它是目前已知的舒血管作用最强的内源性舒血管物质，且可抑制平滑肌细胞增殖。CGRP在CGRP能神经纤维分化成熟，CGRP能神经纤维广泛分布于中枢和外周的血管壁上，在心脏的CGRP能神经纤维一般沿心肌纤维或冠状动 脉平行走向，亦可交织成网，形成神经丛。 

CGRP主要分布于神经系统，亦广泛分布于心血管系统和肺组织内，正常人血浆的CGRP水平为32.9±11.7pg/ml。在心脏CGRP主要存在于心房、心室、室间隔、窦房结、房室结、乳头肌和冠状动脉壁的神经纤维内，在心脏局部副交感神经节、心内膜和外膜亦有CGRP。心内CGRP分布是不均匀的：心房高于心室，右心房高于左心房，近心外膜的含量高于近心内膜的含量。在血管系统，几乎所有的血管床均有CGRP分布，尤以腹主动脉、肠系膜动脉、颈总动脉、肾动脉、中脑动脉、基底动脉、下腔静脉、股静脉的含量为高，其含量最高达50pmol/g。CGRP能神经纤维在血管外膜或平滑肌层交织成网，包绕着整个血管，是调节心血管活动的重要的肽能神经纤维。 

CGRP舒张冠状动脉和脑血管的作用不依赖内皮细胞的完整性，取出内皮细胞其舒张血管的作用依然存在，CGRP对粥样硬化的冠状动脉仍有舒张作用。CGRP舒张血管降低血压的作用可能是对血管的之间抑制作用所引起的，其作用不受预先使用使用肾上腺素受体阻断剂、胆碱能受体或组织胺受体阻断剂，利血平耗竭儿茶酚胺，切除迷走神经或前列腺素合成抑制剂的影响。CGRP对心脏具有正性变力和变时性作用，可使心率加快，心肌收缩力增强，心输出量增加。其作用对心房肌尤其明显，且较去甲肾上腺素强大。在心房、心室和血管存在有CGRP特异性受体，CGRP与其受体结合后，可以激活腺苷酸环化酶，促进细胞内cAMP水平升高发挥其生物学效应。此外，CGRP还可促进前列环素的释放的释放和细胞内外的Na⁺/Ca²⁺交换。 

CGRP作为人体已知最强的扩张血管物质，其舒张作用比较临床上常用的硝酸甘油或硝普钠血管扩张作用强240倍，亦强于P物质、心钠素和异丙基肾上腺素的血管扩张作用。CGRP在临床上可减轻心绞痛，减少心绞痛发作频率，降低高血压，治疗心律失常和心力衰竭。CGRP还可以保护在缺血型情况下心脑肾细胞免受损伤，保护人重要生命器官的功能。CGRP近年来 成为研究心脏和血管系统的热点，在CGRP对心律失常、急性心肌梗塞、冠状动脉造影、心肌缺氧、阿霉素性心肌损伤、高血压和血糖的调节进行了大量的探索和验证实验。鉴于CGRP对于心、脑以及血管的作用，CGRP或其拮抗剂作为药物治疗存在广泛的需求。 

目前CGRP主要依靠化学合成，将氨基酸残基按照CGRP氨基酸序列合成。具有生物活性的成品含量低，作用不甚理想，价格昂贵。或者由动物心脏和肌肉为原料提取，但是生产原料有限，成本高；获得的产品纯度和比活性都很低。 

发明内容