[发明专利]建立油菜细胞质类型特异PCR标记以及快速鉴定油菜细胞质类型的方法

权利要求书

1.一种建立油菜细胞质类型目标基因特异PCR标记的方法，其特征在 于，该方法包括下列步骤：

1)以已知细胞质类型的甘蓝型油菜：包括Nap、Pol、Ogu、Cam和改 良Ogu细胞质类型的甘蓝型油菜的gDNA为模板，用以下对扩增引物对 目标基因Orf138、orf222/nad5c、orf224进行一步多重PCR扩增，其中：

第一对引物的序列为：

GAAACGGGAAGTGACAAT

GCATTATTTTCTCGGTCCAT；

第二对引物的序列为：

AGCTGTCTGGAGGGAATC  

GCGGTCTCACGCACTAATC；

第三对引物的序列为：

AGCTGTCTGGAGGGAATC

ACGACATCAAGGAGGAAC；

第一对引物扩增目标基因是Orf138；第二对引物扩增目标基因是 orf222/nad5c；第三对引物的扩增目标基因是orf224；

2)一步多重PCR扩增采用20μl的PCR反应体系，进行35个PCR循环 反应，得到片段大小分别为465bp、500bp、747bp、800bp、1102bp的特异 PCR标记，其中，465bp和500bp的标记标示ogu细胞质类型，1102bp和800bp 的标记标示nap细胞质类型，747bp和500bp的标记标示pol细胞质类型， 800bp和500bp的标记标示Cam细胞质类型，1102bp和465bp的标记标示 改良ogu细胞质类型。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述20μl PCR反应体系和 PCR循环反应如下：

20μlPCR反应体系包括10mM Tris-HCl、50mM KCl、1.5mM MgCl₂、 250μM四种dNTP、0.5μM各条引物、0.5U Taq DNA酶和50ng基因组 DNA；

PCR循环反应程序为：

变性：94℃，2min；循环反应：94℃，30s，54℃，50s，72℃，70s，  共35个循环；最后延伸：72℃，7min。

3.权利要求1所述的建立油菜细胞质类型目标基因特异PCR标记的方 法在鉴定油菜细胞质类型中的应用，其特征在于，按以下步骤进行：

(a)以待测油菜基因组DNA为模板，重复权利要求1中所述的一步 多重PCR扩增；

(b)检测PCR扩增产物，取步骤(a)中的5μlPCR产物用2％的琼脂 糖电泳，100V电压下电泳35min左右，电泳缓冲液为TAE；溴化乙锭染色； 用凝胶成像系统观察照相；

(c)将步骤(b)中得到的电泳结果与权利要求1建立的特异PCR标 记进行比对，从而得出待测油菜的细胞质类型。