[发明专利]建立油菜细胞质类型特异PCR标记以及快速鉴定油菜细胞质类型的方法

说明书

技术领域

本发明涉及油菜细胞质类型的鉴定，尤其涉及建立油菜细胞质类型目标 基因特异PCR标记的方法，以及利用建立的标记快速鉴定油菜细胞质类型的 方法。

背景技术

油菜细胞质具有高度异质性，是由细胞质基因组载体-线粒体基因组 DNA序列决定的，不受油菜细胞核基因以及环境因素的影响。目前，国内外 已报道的油菜细胞质类型较多，常见的细胞质类型主要有：Nap细胞质类型 (Nap)、波里玛系统细胞质(Pol)/陕2A细胞质类型、Cam细胞质类型、 萝卜质细胞质类型(Ogu)等。

目前，油菜细胞质类型主要通过普通遗传学方法研究、线粒体基因组 DNA的限制性酶切片段长度多态性(即mtDNA-RFLP)标记2种进行鉴定。用 普通遗传学方法对正常油菜品种的细胞质类型鉴定，一般用待测油菜品种做 母本(人工去雄)，与某种已知细胞质雄性不育类型的保持系杂交，根据该 组合F₂群体中是否出现不育株，来确定待测品种的细胞质类型。如果F₂群 体出现不育株，则说明待测品种具有该种不育胞质；如果全可育，则说明待 测品种具有相对于该种不育胞质来说，称为正常可育的胞质。该方法需要进 行油菜杂交试验，一般需要3个时代(2～3年)时间；费时费力，且每种 杂交组合只能确定待鉴定油菜和某种已知胞质类型的油菜是否为相同的细 胞质；如果不是相同的细胞质类型，则仍不能确定待鉴定油菜的细胞质到底 是那种类型。利用上述遗传学方法，Shiga(1976，1977，1978)对来自日 本和欧洲的162个油菜品种，胡琼等(1992)对来自8个国家的43个油菜 品种的细胞质类型进行了鉴定。随着分子生物学理论和技术的发展，有些研 究者已通过分离提取油菜线粒体基因组(mtDNA)，利用mtDNA-RFLP标 记(杨光圣等，中国农业科学，1998，31(1)：27-31)或基因组重复序列 的PCR技术(rep-PCR)(程计华等，作物学报，2008，34(11)：1946-1952) 区别和鉴定油菜各种细胞质类型。利用这两种分子标记方法鉴定油菜细胞质 类型，与普通遗传学方法比较，实验周期大大缩短，但是都需分离纯化油菜 线粒体和提取线粒体DNA，且mtDNA-RFLP方法需要进行mtDNA的限制 性酶切和酶切片段的分离检测，操作程序繁琐、复杂、技术难度大而且成本 高。

目前，甘蓝型油菜Nap细胞质类型的线粒体全基因组已被测序。国内外 研究已表明，不同油菜细胞质类型的mtDNA组织结构差异较大；油菜细胞 质雄性不育系的线粒体基因组中具有与其细胞质雄性不育相关的特异基因 片段。研究已揭示出Ogu、Nap和Pol等不育系的不育性状相关的线粒体基 因序列分别为其mtDNA的特异读码框Orf138、orf222/nad5c、以及 Orf224/atp6。危文亮等(2005，中国农业科学，38(10)：1965-1972)根据 油菜线粒体基因Orf138、orf222/nad5c、以及Orf224/atp6序列和已发表的拟 南芥线粒体基因组序列设计PCR引物，可特异扩增出目标片段。程计华等(作 物学报，2008，34(11)：1946-1952)也得到类似的实验结果。mtDNA这 些特异基因序列是受细胞质遗传的，不受油菜细胞核基因以及环境因素的影 响。因此，依据不同细胞质类型油菜线粒体DNA特异序列开发的分子标记可 作为鉴定油菜细胞质类型的可靠分子标记。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种建立油菜细胞质类型目标基因特异PCR 标记的方法，以及利用建立的该油菜细胞质类型目标基因特异PCR标记，用 于快速鉴定油菜细胞质类型的用途。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种建立油菜细胞质类型目标基因特异PCR标记的方法，其特征在于， 该方法包括下列步骤：

1)以已知细胞质类型的甘蓝型油菜：包括Nap类型、Pol类型、Ogu 类型和Cam类型的gDNA为模板，用以下3对扩增引物对目标基因Orf138、 orf222/nad5c、orf224进行一步多重PCR扩增，其中：

第一对引物的序列为：

GAAACGGGAAGTGACAAT

GCATTATTTTCTCGGTCCAT；

第二对引物的序列为：

AGCTGTCTGGAGGGAATC