[发明专利]一种建立兰州百合高效基因枪转化体系的方法

说明书

发明领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及兰州百合基因枪高频转化方法。

技术背景：

兰州百合(Lilium davidii var.unicolor)是百合科百合属川百合的一个变种，是一种多年生鳞茎类草本植物。兰州百合的栽种始于清代同治年间，距今约130多年，由于独特的土壤条件和多年积累的栽培技术，其鳞茎硕大，颜色洁白，鳞片丰满白嫩，质地细腻，营养丰富，口味甜美而幽香；其花单生，大而美丽，香味浓郁，有很高的食用、药用、保健和观赏价值，它不仅是中国百合中的上品，而且是中国唯一的甜百合。我国著名的植物分类学家孔宪武教授曾评价：“兰州百合味极甜美，纤维很少，又毫无苦味，不但闻名全国，亦可称世界第一。”

近年来对兰州百合的研究主要集中在种植栽培、贮存保鲜、化学成分、细胞学、分子学、保健食品开发、杂交育种、组织培养、离体快繁等方面。百合已被国家卫生部确定为“既是食品又是药品”的植物之一，兰州百合的营养成分丰富，包括各种蛋白质、脂肪和维生素等。不仅在营养方面具有重要的价值，而且兰州百合还具有重要药用价值和观赏价值。

我国是百合属植物的故乡，观赏、食用或药用百合的栽培历史十分悠久，具备良好的种质资源基础。但目前我国的百合育种工作十分落后，现有的百合种质资源不仅没有得到充分利用，而且破坏、流失现象十分严重。百合通常采用分球、鳞茎等繁殖，易造成种性退化，品质下降，甚至凝聚病毒。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题与缺陷，本发明的目的在于提供兰州百合高效率基因枪转化方法，该转化方法具有高效表达、原核基因无需修饰改造、便于遗传操作，易保持纯系，后代不分离，大大提高了兰州百合的转化效率。

实现上述发明目的技术方案是：一种建立兰州百合高效基因枪转化体系的方法，具体包括下列步骤：

选择兰州百合组培苗的鳞片作为受体材料，用基因枪法将外源DNA导入该受体材料，在该基因枪中，采用氯化钙和亚精胺包被质粒DNA，浓度为0.4-1.2mg/L，使用1um金粉作为DNA质粒的载体，轰击高度为3-9cm，轰击次数为1-3次。

本发明的方法中，转化的外源基因是GLDH，转化表达载体为pCAMBIA1303。

本发明还有一个目的是提供一种制备转基因兰州百合的方法，该方法包括以下步骤：

1)将兰州百合组培苗的鳞片在含有0.2-0.6M山梨醇和0.2-0.6M甘露醇高渗培养基上预培养4h；

2)以预培养后的鳞片作为转化受体进行基因枪转化，采用氯化钙和亚精胺包被质粒DNA，浓度为0.4-1.2mg/L，直径为1um的金粉作为DNA质粒的载体，轰击高度为3-9cm，轰击次数为1-3次；

3)将轰击后鳞片在高渗培养基上培养16h，而后在分化培养基上恢复培养7d；

4)经恢复培养后的鳞片，在筛选压力为2mg/L潮霉素分化培养基上筛选培养30d，后转入5mg/的再生培养基上继续进行筛选培养直至再生成植株；

所述的高渗培养基由MS+2.0mg/LBA+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂组成；

所述的分化培养基由MS+2.0mg/LBA+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂组成；

所述的潮霉素分化培养基由MS+2.0mg/LBA+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂+2mg/L hyg组成；

所述的再生培养基由MS+1.0mg/LBA+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂组成。

在上述方法中转化的外源基因是GLDH，转化表达载体为pCAMBIA1303。

本发明的方法成功地将GLDH基因导入到兰州百合基因组中，从而获得了移栽成活的潮霉素抗性株系。

与现有技术相比较，本发明的方法具有以下优点：

1)通过本发明的方法获得转基因植株兰州百合可以明显提高Vc含量2-5倍，从而增加兰州百合的实用价值。

2)本发明的方法转化效率高达15％，并且育种时间仅需半年，与传统育种相比大大缩短了兰州百合的育种时间。

附图说明

图1是获得的抗性芽在潮霉素浓度为5mg/L的培养基上进行筛选培养。

图2为转基因植株的GUS染色。

图3PCR检测的电泳图。

图4转基因植株的Southern杂交图片。

图5是转基因兰州百合在生根培养基上的生长情况。

具体实施方式