[发明专利]一种检测葡萄抗黑痘病基因的分子标记方法

权利要求书

1.一种检测葡萄抗黑痘病基因的分子标记方法，其特征是采用以下技术操作步骤进行：

1.a以葡萄抗黑痘病育种的种间杂交组合白河-35-1×佳利酿的双亲、F₁代及F₂代为试材，提取、分离、纯化脱氧核糖核酸(DNA)

1.b采用随机扩增多态性脱氧核糖核酸(RAPD)技术，用Operon公司的随机引物196个，分别进行脱氧核糖核酸(DNA)的扩增，其中序列为5’CAGAGGTCCC 3’的随机引物OPS03可以扩增区分抗黑痘病与感黑痘病的杂种、亲本，获得了大小约为1300对碱基的脱氧核糖核酸(DNA)片段，该DNA片段是与葡萄抗黑痘病基因相连锁的分子标记；

1.c用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒从琼脂糖凝胶中提取纯化该脱氧核糖核酸(DNA)片段；

1.d以pGEM-T载体连接脱氧核糖核酸片段，4℃下保持16小时；

1.e转化大肠杆菌DH5α，提取质粒DNA，并于37℃水浴中2小时进行酶切；

1.f将鉴定为阳性克隆的菌液测定该DNA片段的碱基构成及其序列；

1.g获得了该脱氧核糖核酸(DNA)片段的实际大小为1354碱基对的全部碱基组成及其序列，即获得了基因标记为1354碱基对的全部碱基组成及其序列；

1.h进一步依据1354碱基对的全部碱基组成及其序列；

1.i人工合成4个寡聚核苷酸，其中的1个寡聚核苷酸5′ACAATCACCCAACTCCTC 3′可用作引物；

1.j对原杂交组合双亲及其F₁代、F₂代，中国野生葡萄，欧洲葡萄，美洲野生葡萄，以及杂交组合广西-1×京可晶的亲本及其F₁代的脱氧核糖核酸(DNA)作模板进行PCR扩增；

1.k获得特异性脱氧核糖核酸(DNA)片段；

1.l用上述方法回收、克隆、测序该DNA片断；

1.m获得该特异性脱氧核糖核酸(DNA)序列大小为1110碱基对，即获得了基因标记为1110碱基对的序列；

1.n人工合成的寡聚核苷酸5′ACAATCACCCAACTCCTC 3′用作引物，对原杂交组合双亲及其F₁代、F₂代，中国野生葡萄，欧洲葡萄，美洲野生葡萄，以及杂交组合广西-1×京可晶的亲本及其F₁代的抗黑痘病性状可以检测出来，并以1110对碱基的脱氧核糖核酸(DNA)片段表现了拥有葡萄抗黑痘病性状和抗黑痘病基因；

1.o确定人工合成的寡聚核苷酸5′ACAATCACCCAACTCCTC 3′作为检测葡萄抗黑痘病基因的DNA探针。

2.根据权利要求1所述的一种检测葡萄抗黑痘病基因的分子标记方法，其特征是用脱氧核糖核酸(DNA)作模板进行RAPD扩增的具体步骤为：

2.b.1采用聚合酶链反应(PCR)

2.b.1.1混合液体积为25微升

2.b.1.2含有10×PCR缓冲液2.5微升

2.b.1.3氯化镁1.5毫摩尔/升

2.b.1.4dNTP 200微摩尔/升

2.b.1.5Taq DNA聚合酶1个单位

2.b.1.6序列为5’CAGAGGTCCC 3’的随机引物OPS031微升

2.b.1.745毫微克的模板脱氧核糖核酸(DNA)；

2.b.2用25微升的矿物油覆盖反应液

2.b.2.1PCR仪为Eppendorf-AG22331型

2.b.2.2聚合酶链反应94℃下解链5分钟；

2.b.3进行45个循环

2.b.3.1每一个循环包括94℃下解链1分钟

2.b.3.236℃下引物附着模板脱氧核糖核酸1分钟

2.b.3.372℃下脱氧核糖核酸(DNA)聚合链的延伸2分钟

2.b.3.4最后一个循环是72℃下延伸10分钟后；

2.b.4将扩增产物在4℃下保存或直接用琼脂糖凝胶电泳

2.b.4.1琼脂糖凝胶浓度为1.2％

2.b.4.2加入溴化乙锭0.5毫微克/毫升

2.b.4.3电泳的电压为110伏

2.b.4.4用水平板电泳槽电泳1-1.5小时；

2.b.5电泳结束后，在紫外灯下照相。