[发明专利]一种检测葡萄抗黑痘病基因的分子标记方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测基因的分子标记方法，特别是涉及一种检测葡萄抗黑痘病基因的分子标记方法，和脱氧核糖核酸(DNA)片段的序列以及作为检测葡萄抗黑痘病基因探针的寡聚核苷酸序列，属于植物基因工程领域。

背景技术

葡萄是一种世界性水果，其面积和产量均居各类水果的第二位，葡萄黑痘病是一种严重危害葡萄的真菌病害，尤其是在葡萄生长季节雨水较多、湿度较大的地区，危害严重，常造成葡萄落花落果，叶片穿孔脱落，果粒上有鸟眼状黑斑等，严重影响葡萄的生长及果实品质与产量。传统防治葡萄黑痘病的方法是对葡萄进行多次喷药防病，但化学防治会造成果实残毒、污染环境，不利于人们的身体健康。利用葡萄资源自身的抗病性，通过杂交育种是培育抗黑痘病葡萄新品种的根本途径，但通过杂交育种的方法，选育出抗黑痘病新品种的周期较长，一般鉴定杂种抗黑痘病性能需3-5年，这种人力、物力、时间耗费多而效率低的育种方法远远不能满足生产的实际需要。

随机扩增多态性脱氧核糖核酸(RAPD)是一项分子标记技术，具有快速、简便、成本低、多态性检测丰富、不需同位素示踪和安全可靠的特点，可以用于检测目标基因的存在与否，在分子生物学研究领域及农作物育种方面得到广泛的应用，并取得明显成效。

发明内容

本发明的目的是解决传统杂交育种中，葡萄抗黑痘病育种周期长、效率低的难题，而公开一种用于葡萄抗黑痘病育种中检测抗黑痘病基因的分子标记方法。

本发明采用随机扩增多态性脱氧核糖核酸(RAPD)技术，对葡萄抗黑痘病育种而获得的种间杂交F₁、F₂代幼苗进行研究，寻找与葡萄抗黑痘病基因连锁的DNA分子标记，用于抗黑痘病育种的早期筛选鉴定，对分子标记研究它的DNA序列组成，合成寡聚核苷酸，发展应用成检测葡萄抗黑痘病性状的探针。

本发明采用随机扩增多态性脱氧核糖核酸(RAPD)技术，获得了葡萄抗黑痘病育种的基因标记与脱氧核糖核酸(DNA)序列，基因标记为1354碱基对组成及其序列，由此序列为模板，利用人工合成的寡聚核苷酸5’ACAATCACCCAACTCCTC 3’作引物，具有检测葡萄抗黑痘病基因存在与表达的功能。

本发明技术操作步骤如下：

a.以葡萄抗黑痘病育种的种间杂交组合白河-35-1×佳利酿的双亲、F₁代及F₂代为试材，提取、分离、纯化脱氧核糖核酸(DNA)；

b.采用随机扩增多态性脱氧核糖核酸(RAPD)技术，用Operon公司的随机引物196个，分别进行脱氧核糖核酸(DNA)的扩增，其中序列为5’CAGAGGTCCC 3’的随机引物OPS03可以扩增区分抗黑痘病与感黑痘病的杂种、亲本，获得了大小约为1300对碱基的脱氧核糖核酸(DNA)片段，该DNA片段是与葡萄抗黑痘病基因相连锁的分子标记；

c.用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒从琼脂糖凝胶中提取纯化该脱氧核糖核酸(DNA)片段；

d.以pGEM-T载体连接脱氧核糖核酸片段，4℃下保持16小时；

e.转化大肠杆菌DH5α，提取质粒DNA，并于37℃水浴中2小时进行酶切；

f.将鉴定为阳性克隆的菌液测定该DNA片段的碱基构成及其序列；

g.获得了该脱氧核糖核酸(DNA)片段的实际大小为1354碱基对的序列，即获得了基因标记为1354碱基对的序列；

h.进一步依据1354碱基对的全部碱基组成及其序列；

i.人工合成4个寡聚核苷酸，其中的1个寡聚核苷酸5′ACAATCACCCAACTCCTC 3′可用作引物；

j.对原杂交组合双亲及其F₁代、F₂代，中国野生葡萄，欧洲葡萄，美洲野生葡萄，以及杂交组合广西-1×京可晶的亲本及其F₁代的脱氧核糖核酸(DNA)作模板进行PCR扩增；

k.获得特异性脱氧核糖核酸(DNA)片段；

l.用上述方法回收、克隆、测序该DNA片断；

m.获得该特异性脱氧核糖核酸(DNA)序列大小为1110碱基对，即获得了基因标记为1110碱基对的序列；