[发明专利]模拟IBDV多表位基因的分子设计及其应用

说明书

一、技术领域

本发明涉及模拟传染性法氏囊病病毒(IBDV)多表位基因epis的分子设计、序列(包括epis部分以及n次重复序列)、表达质粒构建以及疫苗制备方法，属于生物制药领域。

二、背景技术

传染性法氏囊病(IBD)是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的以侵害幼鸡淋巴组织，特别是中枢免疫器官—法氏囊为主要特征的传染病。该病在国内外广泛流行，其危害主要包括两个方面：一是引起3～8周龄的鸡发病和死亡，尤其是近年来超强毒株(vvIBDV)的出现使雏鸡死亡率大大增加；二是雏鸡早期感染本病，则引起免疫抑制，导致鸡群对其它疫病的易感性增高和对疫苗的免疫应答能力降低或失败，造成巨大的间接经济损失。

IBDV属双RNA病毒科，基因组包括大(A)小(B)两个片段，已确认有五种病毒蛋白：VP1、VP2、VP3、VP4和VP5。VP1为病毒自身编码的依赖RNA的RNA聚合酶，由B片段编码。其它四种病毒蛋白由A片段编码，VP2和VP3是病毒的主要结构蛋白，构成病毒衣壳，VP2相对含量较多，中和抗原表位主要存在于VP2上，且多为构象依赖性，用构象依赖性中和抗原表位诱导的中和抗体能被动地保护宿主不受IBDV感染，VP4为病毒自身蛋白酶，VP5的功能尚不明确。大肠杆菌表达的VP2免疫原性较差，表明VP2的后加工过程对VP2的结构形成至关重要。

目前，IBD仍然是危害养鸡业的主要传染病之一，虽然研制了多种商品化的弱毒疫苗和灭活疫苗，但其安全性和制造工艺尚有不尽人意之处，如为抵抗超强毒的攻击，使用中强毒力的毒株研制活疫苗，给IBD的防制带来极大的隐患，灭活疫苗存在着抗原制备的困难。因此，国内外学者一直在探索免疫原性好且安全性高的新型疫苗，先后运用大肠杆菌、酵母、鸡痘病毒载体、杆状病毒以及核酸疫苗载体单独或者共同表达了A片段cDNA、VP2、VP3和VP4基因。分析这些研究成果，从重组亚单位疫苗到病毒载体疫苗以及核酸疫苗，有的不能产生中和抗体，有的则不能兼顾高保护力和囊损伤问题，有的还存在着表达量低、保护率低、免疫程序复杂以及难以工业化标准生产等缺点。

蛋白质分子上的抗原表位(亦称抗原决定簇)是蛋白质抗原性的物质基础。近年来研究发现的模拟抗原表位，本质上是构象依赖性表位，虽然模拟表位的氨基酸顺序与蛋白质分子一级结构的氨基酸顺序截然不同，却可以引起特异性的免疫反应，因此，在免疫应答中的地位极为重要。用常规基因克隆表达方法研制的重组亚单位疫苗，尽管人们采用多种方法进行复性，仍然难以完全恢复到天然的构象，导致部分构象依赖性抗原表位丢失，其中可能是中和抗原表位，从而影响到机体产生完全有效的保护性免疫应答。IBDV的中和抗原表位主要存在于结构蛋白VP2上，均为构象依赖性，因此，采用克隆表达IBDV病毒结构蛋白基因研制IBD基因工程疫苗的常规思路和方法，使重组蛋白难以完成天然的蛋白质构象，导致部分构象依赖性抗原表位缺失或改变，其中很多是重要的具有保护作用的中和抗原表位，从而影响到机体产生完全有效的保护性免疫应答。对此，人们采用了不同的研究策略，例如，改变表达方法和表达系统、对重组蛋白结构进行充分地复性等，这些措施采取后，蛋白质结构问题可能部分解决，但又会出现表达量低、制备工艺复杂或生产成本高等新的问题。这表明，采用新的研究思路和技术路线制备新型IBD基因工程疫苗的必要性与紧迫性。

三、发明内容

技术问题  本发明针对IBD基因工程疫苗研究难点，将抗原表位免疫应答的分子免疫学理论应用于基因工程疫苗研究，突破了以往采用克隆表达病毒结构蛋白基因方法进行基因工程疫苗研究的传统思路和方法。制备IBDV中和表位与优势抗原表位单克隆抗体，综合运用单克隆抗体与噬菌体展示随机肽库技术，分析IBDV保护性免疫应答相关的中和抗原表位和优势抗原表位，设计合成具有免疫保护功能的模拟IBDV多表位基因epis，制备IBDV表位基因工程疫苗。在进行epis分子设计时，由于采用线性化序列模拟了IBDV空间构象依赖性表位基序，因此大肠杆菌表达的重组IBDV多表位蛋白rEPIS制备工艺简单、成本低、生物安全性高。

技术方案

模拟IBDV多表位基因epis，其特征在于，该基因的长度为471bp，编码155aa，命名为epis，其序列为SEQ ID NO.1。其所编码的多表位蛋白rEPIS，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。模拟IBDV多表位基因epis的重组表达质粒pET-epis，其构建方法为：