[发明专利]一株耐碱芽孢杆菌菌株及其产生的果胶酶

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一株高产耐热嗜碱果胶酶的耐碱芽孢杆菌Bacillus alcalophilus M29及其产生的耐热嗜碱果胶酶，本发明还涉及Bacillusalcalophilus M29在发酵生产果胶酶中的应用。

背景技术

果胶酶是指能分解果胶质的一类酶，碱性果胶酶(E.C.4.2.2.2)是指在碱性范围内具有较高活性的一类果胶酶。自1972年日本学者KokiHorikoshi首次用嗜碱细菌制得碱性果胶酶以来(Hoondal G.S.，et al.Appl Microbiol Biotechnol，2002，59：409～418)，其应用研究越来越广泛。碱性果胶酶除了在植物病毒的纯化、纸浆漂白等方面得到应用以外，已成为棉织物预处理过程中至关重要的生物酶制剂。碱性果胶酶的使用将改变传统的碱精练工艺，不仅减少环境污染，节约大量的工艺用水，而且可提高棉纺织物的品质。碱性果胶酶应用领域，还包括造纸、环境和食品等领域。然而，由于碱性果胶酶高产菌极少，产酶成本较高，热稳定性较低，其工业化生产程度还很低，因此，选育高产菌株来提高其热稳定性、碱稳定性、提高碱性果胶酶产率、降低产酶成本是研究开发和应用碱性果胶酶的关键。

发明内容

本发明的目的是提供一株具有高产碱性果胶酶能力、较好的热稳定性的微生物菌株及其产生的果胶酶，并提供一种利用该菌株发酵生产碱性果胶酶的方法，使得该方法能成功应用于果胶酶的生产。

为解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案实现：

一、本发明以高浓度果胶作为唯一碳源从土壤中筛选到一株耐碱芽孢杆菌菌株，分类命名为Bacillus alcalophilus M29，保藏日期为2009年1月6日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，其保藏登记号为CCTCC NO：M 209006。

(一)耐碱芽孢杆菌Bacillus alcalophilus M29的筛选及鉴定方法：

1、初筛

从自然界中采集土样约1500个，取3～4种土样各1g左右加入盛入有10mL筛选培养基的试管中，于55℃、200r·m^-1条件下富集培养三至四天后，转接于新鲜的筛选培养中，转接3～4次后，取少量培养液适当稀释，均匀涂布于筛选平板培养基上。培养18h后，观察菌落周围的透明圈，将有明显透明圈的菌种进化单离，并接种于肉汤平板培养基培养。

2、复筛

从肉汤培养基上刮取一环菌体，接种至装有发酵培养基的摇瓶中，55℃、200r·m^-1条件下培养18h后离心，将所得上清加入含2％聚半乳糖醛酸底物的碳酸钠缓冲液(pH10.0)中转化10h，转化液离心后的上清用于检测果胶酶活性，得到果胶酶活性最大的一株菌株，命名为M29。

3、菌株的鉴定

本发明将M29经生理生化实验鉴定，表明M29与芽孢杆菌Bacillus sp.相近，而16SrDNA序列分析鉴定表明与该序列相似度高于98％的菌株均为Bacillus属菌株，其中与菌株Bacillus alcalophilus属相似度为98.9％，证明为耐碱芽孢杆菌的一株新菌株。因此，最终将M29命名为Bacillus alcalophilus M29。

(二)耐碱芽孢杆菌Bacillus alcalophilus M29的形态特征：

本发明对Bacillus alcalophilus M29的生物特征进行了鉴定，该菌株为革兰氏阳性菌，有芽孢形成。在碱性肉汤平板培养基中生长20小时后，菌落大小为2～2.5mm，生长温度范围是45～55℃，最适温度是50℃，生长pH是9.5～10.5，最适pH是10.0，其生理生化表现在，过氧化物酶试验阳性，在有氧条件下生长。

二、本发明所述的耐碱芽孢杆菌Bacillus alcalophilus M29产生的果胶酶，具有较好的热稳定性(45～65℃)、底物耐受性和嗜碱性(8.5～11，最适pH值为10)，属于耐热嗜碱果胶酶。

三、本发明所述的耐碱芽孢杆菌Bacillus alcalophilus M29菌株在发酵制备果胶酶中的应用。其原理如下：

Bacillus alcalophilus M29菌株发酵制备果胶酶的方法：

将菌体在果胶为诱导剂的发酵液中发酵；将发酵液离心，得上清，即为碱性果胶酶。