[发明专利]带背景验证的信号组合编码DNA连接测序方法

权利要求书

1.一种带背景验证的信号组合编码的DNA连接测序方法，其特征在于针对某一种特定的 DNA测序探针，使用一组标记物状态的组合进行标记，一组标记物中的一种作为背景标 记物，剩余的标记物作为编码标记物，对于一批DNA测序探针，采用编码标记物状态的 不同组合方案结合背景标记物进行标记，制备一套带背景验证的信号组合编码的DNA测 序探针，从而实现在检测时对不同DNA测序探针的区分和鉴别；所述标记物的状态，包 括标记物“有信号”、“无信号”两种状态，以及标记物不同信号强度比例的状态：

A  一套带背景验证的信号组合编码的DNA测序探针的制备：首先制备未标记的DNA 测序探针，每一种未标记的DNA测序探针由一个或多个测序碱基、一个或多个简并 碱基N组成；测序碱基用于通过碱基互补配对法则测定待测DNA中相应位置的碱基 信息，简并碱基N为A、T、C、G四种碱基中的任意一个；完成未标记的DNA测序 探针的制备后，针对每一种未标记的DNA测序探针，采用多种编码标记物状态的一 种组合进行标记，同时标记背景标记物，每种编码标记物在该DNA测序探针上标记 与否及标记的量由该编码标记物在状态的组合中所对应的状态决定；采用不同的状态 组合方案结合背景标记物对不同的未标记DNA测序探针进行标记，完成一套带背景 验证的信号组合编码的DNA测序探针的制备；

B  利用上述一套带背景验证的信号组合编码的DNA测序探针的测序流程如下：

a.选取一条测序引物与待测的DNA模板依据碱基互补配对原理进行杂交；

b.向反应体系中加入上述的一套带背景验证的信号组合编码的DNA测序探针和 DNA连接酶及其反应体系，进行DNA连接反应；

c.完成DNA连接反应后，检测全部参与状态组合的标记物及背景标记物的信号， 首先判读背景标记物是否符合校验，如符合，判读编码标记物信号所处的状态， 根据全部编码标记物状态的组合情况，确定发生连接反应的DNA测序探针的种 类，从而确定该测序探针上测序碱基的类型和排布，并最终确定被测DNA模板 上对应位置的碱基或碱基序列信息；

d.完成对标记物信号的检测后，移除DNA测序探针上的标记物；

e.重复上述步骤b-d直至DNA测序探针达到或超出待测DNA模板待测区域末端；

f.该测序引物与待测DNA模板变性分离，选取第二条测序引物；

g.重复上述步骤a-f，直至全部未知DNA模板的待测区域的全部序列信息得以确定。

2.根据权利要求1所述的带背景验证的信号组合编码的DNA连接测序方法，其特征在于所 述的多种标记物对未标记DNA测序探针进行组合标记，其方案是对同一DNA测序探针 分子同时标记一种或多种标记物，或者分别用不同的标记物标记同一种DNA测序探针的 不同分子，随后将上述不同测序探针分子混合。

3.根据权利要求1所述的带背景验证的信号组合编码的DNA连接测序方法，其特征在于所 述的测序引物是指一组只能和所有DNA模板的一段通用序列杂交的寡核苷酸片段，一组 测序引物在DNA模板上杂交区域彼此相差一个或数个碱基，能够在数轮测序反应中完成 对DNA模板全长的测序工作；测序模板上的通用序列，是在测序模板制备过程中通过连 接反应加入，或者在扩增过程中通过引物引入。

4.根据权利要求1所述的带背景验证的信号组合编码的DNA连接测序方法，其特征在于所 述的DNA模板是通过对待测的DNA片段通过DNA扩增技术增加基因组中感兴趣的目的 片段的量，扩增是单重的，即一次扩增一个目的片段，或者是多重的，即一次扩增多个目 的片段；所述的待测的DNA模板中的固定是通过化学或者物理方法固定于平面片基上， 或固定于“96孔板”、“384孔板”及各种修饰的珠子载体上。

5.根据权利要求1所述的带背景验证的信号组合编码的DNA连接测序方法，其特征在于所 述的标记物，是采用的荧光基团，或利用测序探针化学的、物理的性质的改变。