[发明专利]带背景验证的信号组合编码DNA连接测序方法

说明书

技术领域

本发明带背景验证的信号组合编码DNA连接测序方法涉及一种采用信号组合编码的DNA 连接测序方法，并结合背景验证方案，是一种实现DNA序列分析的方法，属于生物技术领域。

技术背景

随着基因组研究的深入，特别是人类基因组计划和各种模式生物基因组计划的完成，生 物学研究和医学研究方式产生了巨大变革。从基因水平上认识生命的差异，疾病发生、发展 的规律，药物与生命体的相互作用，不同物种之间的遗传差异以及同一物种内部不同个体间 的遗传差异成为可能。尽管导致疾病发生的因素众多，但基因序列差异(包括单核苷酸多态 性、DNA甲基化等)被广泛认为是一个重要的内在因素。多数复杂疾病发生和发展，如癌症、 糖尿病、心血管疾病、精神疾病等，是众多基因和环境共同作用的结果。通过对某一特定疾 病大量基因组样本中基因突变的大规模检测及与非患病对照基因组样本的比对，即可获得与 该疾病有关的基因型信息，通过随后对药物敏感基因突变位点的筛查，可以获得对临床治疗 与用药具有指导性意义的信息。无论是亲缘关系较近的物种之间遗传差异，还是同一物种内 部不同个体之间的遗传差异，都主要是以基因序列差异的形式体现出来。因此，如何快速的 筛查基因组中的基因序列差异成为后基因组时代的主要课题之一。

现有的基因序列差异的检测方法主要为：传统Sanger DNA测序法、限制性酶切长度多态 性、单链构象多态性和基于基因芯片的寡核苷酸探针杂交法等。在这些方法中，仅有传统的 Sanger DNA测序法能完成对目标片段的全方位序列测定，其余方法均只能确定很少的一部分 序列信息。但传统的Sanger DNA测序法存在通量低、成本高、耗时长等不足。第一个人类基 因组序列测定的费用大约为10亿美元。尽管这一费用目前已经降低到2000万美元，但依然 是制约功能基因组研究的瓶颈，大幅度降低DNA测序的成本将会大大推动生命科学的发展。 为此，美国Venter基金会在2003年提出了1000美元人类全基因组测序的研究目标。2004 年初，美国国立卫生院投入4千多万美元支持DNA测序新技术的研究计划，累计已经超过1 亿美元。其目标是发展10万美元的人类全基因组DNA测序技术，并最终减低为1000美元。

目前，除对现有的基于电泳的测序技术的改进外，正在研发的测序技术总体上可以分为 四类。第一类是合成测序，合成测序又可分成两种，一种是在碱基加入到正在发生聚合反应 的DNA链的过程中进行检测，另一种在寡核苷酸加入到正在发生延伸反应的DNA链的过程中 进行检测；第二类是杂交测序法，通过制备一组高密度寡核苷酸微阵列芯片的杂交信号，进 行目标基因的序列鉴定；第三类是分子影像等一系列可以在单分子的水平上进行测序的技术； 最后一类技术是诱导DNA分子蜿蜒通过非常细微的小孔，在这个过程中借助电子学或者光学 的方法对碱基进行读出，也成为纳米孔道测序技术。

目前，除对现有的基于电泳的测序技术的改进外，正在研发的测序技术总体上可以分为 四类。第一类是延伸测序法，将信号标记的碱基加入到正在发生聚合反应的DNA链中进行 检测，第二类是连接测序法，将信号标记的寡核苷酸片段加入到正在发生连接反应的DNA 链中进行检测；第三类是杂交测序法，通过制备一组高密度寡核苷酸微阵列芯片的杂交信号， 进行目标基因的序列鉴定；第四类是分子影像等一系列可以在单分子的水平上进行测序的技 术；最后一类技术是诱导DNA分子蜿蜒通过非常细微的小孔，在这个过程中借助电子学或 者光学的方法对碱基进行读出，也成为纳米孔道测序技术。目前只有延伸测序方法和连接测 序方法用于全基因组测序，并且开发出了商品化的仪器和试剂，大大提高了DNA测序的效 率，大幅度降低了DNA测序的成本。然而，目前新一代的DNA测序在测序成本、通量和速 度等方面仍然不能满足生命科学研究的需要。主要原因之一是在检测核酸的信号标记方法单 一、效率不高。例如，在DNA连接测序方法中，受标记物(如荧光基团)种类的限制，每 次连接反应一般仅能确定一个碱基的信息，如需在一次连接反应确定两个及两个以上碱基信 息，则需要对标记物进行二维或多维编码。然而现有编码方法对多种标记物都“无信号”的 状态和未成功发生连接反应的“空信号”之间无法有效分辨，测序反应的存在一定的错误率。

发明内容