[发明专利]猪肺炎支原体P36基因重组毕赤酵母及表达蛋白有效

专利信息
申请号: 200910027160.4 申请日: 2009-05-22
公开(公告)号: CN101565681A 公开(公告)日: 2009-10-28
发明(设计)人: 邵国青;祝永琴;冯志新;刘茂军;王海燕;吴叙苏;甘源 申请(专利权)人: 江苏省农业科学院
主分类号: C12N1/19 分类号: C12N1/19;C12N15/81;C12P21/02;C12R1/84
代理公司: 南京经纬专利商标代理有限公司 代理人: 张素卿
地址: 210014*** 国省代码: 江苏;32
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摘要:
搜索关键词: 肺炎 支原体 p36 基因 重组 酵母 表达 蛋白
【权利要求书】:

1.猪肺炎支原体P36基因重组毕赤酵母,该重组毕赤酵母X-33/pPICZα-A/P36属巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris),于2009年4月13日保藏于中国典型培养物保藏中心,菌种保藏号为CCTCC NO:M209070。

2.权利要求1所述的猪肺炎支原体P36基因重组毕赤酵母X-33/pPICZα-A/P36的构建方法,其特征在于:

1)引物设计

设计引物序列为:

P1:5′-CCCGAATTCATGAAACCTATTAAAATAGCTCT-3′    EcoR I

P2:5′-GCGTCTAGATTAAATATTTTTAATTGCATCCTGAT-3′ Xba I

2)PCR获取P36目的基因

以P1和P2为引物,猪肺炎支原体JS99株DNA为模板进行PCR扩增,取10μL PCR产物于质量比1%TAE琼脂糖凝胶中电泳,回收PCR产物;

3)将获取的P36目的基因克隆入pPICZα-A表达载体并进行序列测定

PCR产物和pPICZα-A均用EcoR I、Xba I双酶切,T4DNA连接酶连接,连接产物转化E.coli DH5α获重组表达质粒,重组表达质粒用EcoR I、Xba I双酶切进行鉴定,37℃水浴2h,琼脂糖凝胶电泳鉴定,可见约965bp的条带,测序见SEQ ID NO.1,重组表达质粒命名为pPICZα-A/P36;

4)重组酵母菌株的筛选和鉴定

毕赤酵母X-33感受态与Sac I线性化的pPICZα-A/P36相混合,转移至预冷的0.2cm电转杯中,置冰上5min,1.5kV、25μF、200Ω电击,立即加入1mL预冷的1mol/L山梨醇,取200μL涂布于YPDS平板上,30℃培养至单菌落出现,采用PCR方法分析毕赤酵母转化子,用煮-冻-煮法制备PCR模板,以通用引物5’AOX和3’AOX为引物,其序列分别为5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′,和5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′进行PCR鉴定,筛选到的阳性克隆即为毕赤酵母X-33/pPICZα-A/P36。

3.权利要求1或2所述猪肺炎支原体P36基因重组毕赤酵母表达的蛋白制备方法,其特征在于,

将毕赤酵母X-33/pPICZα-A/P36接种到BMGY中,28℃、振荡培养约22h至OD600达到2~6,室温离心,收集菌体重悬于BMMY培养基,进行诱导表达,28℃、振荡培养约72h,期间每24h补加至终浓度体积比为1%的甲醇,96h后,5000r/min离心10min,收集培养液上清,表达蛋白以可溶形式存在于上清液。

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