[发明专利]猪肺炎支原体P36基因重组毕赤酵母及表达蛋白

权利要求书

1.猪肺炎支原体P36基因重组毕赤酵母，该重组毕赤酵母X-33/pPICZα-A/P36属巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)，于2009年4月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO：M209070。

2.权利要求1所述的猪肺炎支原体P36基因重组毕赤酵母X-33/pPICZα-A/P36的构建方法，其特征在于：

1)引物设计

设计引物序列为：

P1：5′-CCCGAATTCATGAAACCTATTAAAATAGCTCT-3′    EcoR I

P2：5′-GCGTCTAGATTAAATATTTTTAATTGCATCCTGAT-3′ Xba I

2)PCR获取P36目的基因

以P1和P2为引物，猪肺炎支原体JS99株DNA为模板进行PCR扩增，取10μL PCR产物于质量比1％TAE琼脂糖凝胶中电泳，回收PCR产物；

3)将获取的P36目的基因克隆入pPICZα-A表达载体并进行序列测定

PCR产物和pPICZα-A均用EcoR I、Xba I双酶切，T4DNA连接酶连接，连接产物转化E.coli DH5α获重组表达质粒，重组表达质粒用EcoR I、Xba I双酶切进行鉴定，37℃水浴2h，琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见约965bp的条带，测序见SEQ ID NO.1，重组表达质粒命名为pPICZα-A/P36；

4)重组酵母菌株的筛选和鉴定

毕赤酵母X-33感受态与Sac I线性化的pPICZα-A/P36相混合，转移至预冷的0.2cm电转杯中，置冰上5min，1.5kV、25μF、200Ω电击，立即加入1mL预冷的1mol/L山梨醇，取200μL涂布于YPDS平板上，30℃培养至单菌落出现，采用PCR方法分析毕赤酵母转化子，用煮-冻-煮法制备PCR模板，以通用引物5’AOX和3’AOX为引物，其序列分别为5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′，和5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′进行PCR鉴定，筛选到的阳性克隆即为毕赤酵母X-33/pPICZα-A/P36。

3.权利要求1或2所述猪肺炎支原体P36基因重组毕赤酵母表达的蛋白制备方法，其特征在于，

将毕赤酵母X-33/pPICZα-A/P36接种到BMGY中，28℃、振荡培养约22h至OD₆₀₀达到2～6，室温离心，收集菌体重悬于BMMY培养基，进行诱导表达，28℃、振荡培养约72h，期间每24h补加至终浓度体积比为1％的甲醇，96h后，5000r/min离心10min，收集培养液上清，表达蛋白以可溶形式存在于上清液。