[发明专利]猪肺炎支原体P36基因重组毕赤酵母及表达蛋白

说明书

一、技术领域

本发明涉及一种猪肺炎支原体P36基因重组毕赤酵母及表达蛋白，属于生物蛋白制备技术领域。特别是涉及猪肺炎支原体P36基因重组毕赤酵母的构建，表达蛋白的制备。制备的蛋白可用于猪肺炎支原体P36蛋白研究、检测试剂盒和基因工程疫苗的研制。

二、背景技术

猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)是引起猪气喘病(MPS)的主要病原。猪气喘病是猪群中流行最广、传播最快、最难净化的疫病之一。猪肺炎支原体通过呼吸道传播，感染呼吸道上皮后导致呼吸道纤毛萎缩、脱落、损坏，上皮细胞坏死，降低呼吸道黏膜的免疫功能，引起肺部功能损伤，容易产生其它呼吸道病原的继发感染。据报道，该病可使猪的饲料转化率降低10％，生长速度降低12％～15％，出栏时间延长1个月，与胸膜肺炎放线杆菌、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒等混合感染时，情况更为严重，该病一旦爆发就难以控制，给养殖业造成巨大的经济损失。

目前对该病致病机理还不十分清楚。在检测方面，国内外已建立了多种血清学检测方法，如免疫琼扩和间接血凝等，但免疫琼扩和间接血凝法存在着灵敏度不高等问题。由于Mhp与非致病支原体之间存在着交叉反应，所以血清学检测方法的研发困难重重。对Mhp标准菌株和野外分离菌株的抗原分析表明，支原体肺炎含有几种主要免疫原，即：胞内具LDH活性的蛋白(P36)，3种膜蛋白(P46、P65和P70)和黏附素(P97)。这些蛋白在急性或初次感染肺炎支原体后，可刺激产生早期和特异抗体。与猪体内常寄居的其他支原体进行比较后发现，P36和P46高度保守，为肺炎支原体种特异性抗原成份，无交叉反应。因此，可以应用P36或P46作为抗原，建立血清学检测方法，用于流行病学调查。P36蛋白抗体的产生会经历两个主要阶段，一是，感染后5～10周，针对P36蛋白的抗体还很低；二是，感染后12周，此时感染动物的临床症状以及肺部病变逐渐消失，而此时P36的抗体滴度增加很快，并且会一直持续到感染后21周。因此用P36蛋白建立ELISA诊断方法，对于猪支原体肺炎的后期诊断有很重要的意义。

而目前的研究主要是在大肠杆菌里对其进行表达，表达的蛋白大多以融合蛋白的形式存在，对后续应用可能存在一定的干扰，并且由于大肠杆菌成份的存在，表达蛋白需要进行烦琐的纯化后才能用于后期的研究。而巴斯德毕赤酵母表达系统是近年发展起来的一种新型真核表达系统，它既可以进行胞内表达，也可进行分泌表达。据报道，在酵母表达系统里表达结核分枝杆菌CFP32蛋白与原核表达系统表达的该蛋白的WesternBlotting结果显示，酵母表达系统表达的该蛋白与抗体的结合能力更强，而且ELISA结果也显示，结核病人的血清以及接种过疫苗的健康人的血清与酵母表达的CFP32蛋白的结合能力较原核表达的该蛋白强。因此，选用了酵母表达系统表达P36蛋白具有较好的前景。

三、发明内容

技术问题

针对上述领域中的缺陷，本发明提供了一种猪肺炎支原体P36基因毕赤酵母表达系统，其表达蛋白纯度高、工艺简单、生物安全度高、成本低廉、易于生产和应用等特点，为进一步P36蛋白的研究、开发研制检测试剂盒和基因工程疫苗奠定基础。

技术方案

本发明的具体实施方案如下：

猪肺炎支原体P36基因重组毕赤酵母X-33/pPICZα-A/P36属巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，于2009年4月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO：M209070。

上述的猪肺炎支原体P36基因重组毕赤酵母X-33/pPICZα-A/P36的构建方法为：

1)引物设计

设计引物序列为：

P1：5′-CCCGAATTCATGAAACCTATTAAAATAGCTCT-3′   EcoR I

P2：5′-GCGTCTAGATTAAATATTTTTAATTGCATCCTGAT-3′Xba I

2)PCR获取P36目的基因

以P1和P2为引物，猪肺炎支原体JS99株DNA为模板进行PCR扩增，取10μL PCR产物于质量比1％TAE琼脂糖凝胶中电泳并观察拍照，回收PCR产物；

3)将获取的目的基因克隆入pPICZα-A表达载体并进行序列测定