[发明专利]一种快速检测氯霉素的免疫磁珠层析试纸条及其制备方法

权利要求书

1、一种氯霉素免疫磁珠层析检测试纸条，其特征是由衬板和在衬板上依次衔接的样品垫、磁标结合垫、包被膜、吸水垫组成，磁标结合垫为吸附氯霉素磁标抗体的玻璃纤维棉，在包被膜上有用氯霉素偶联的载体蛋白溶液印制的直线式隐形检测线T线，用羊抗兔IgG溶液印制的直线式隐形对照线C线；

所述的衬板为不吸水的硬质塑胶条或硬纸条；样品垫为玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜、或聚酯膜；包被膜为硝酸纤维素膜、纯纤维素膜、或羧化纤维素膜；吸水垫为吸水滤纸或滤油纸；

所述的氯霉素磁标抗体为磁珠标记的氯霉素的多克隆抗体；

所述的磁珠为表面修饰有羧基的Fe₃O₄磁珠；

所述的偶联氯霉素的载体蛋白为：牛血清白蛋白BSA、鸡卵清白蛋白OVA。

2、权利要求1所述氯霉素免疫磁珠层析检测试纸条的制备方法，其特征是

1)氯霉素全抗原的合成及鉴定：在DMF溶液中采用混合酸酐法分别将BSA，OVA与氯霉素CAP进行偶联，得到氯霉素的全抗原CAP-BSA以及CAP-OVA，并利用紫外扫描仪进行鉴定；

2)多克隆抗体的制备与纯化：以CAP-BSA作为免疫原，免疫新西兰兔，按常规方法制备CAP多克隆抗体并以硫酸铵纯化；

3)免疫磁珠的制备：将CAP抗体与带羧基的纳米磁珠偶联，制备含CAP抗体的免疫磁珠，即氯霉素磁标抗体；以玻璃纤维棉吸附氯霉素磁标抗体制备磁标结合垫；

4)包埋CAP-OVA及羊抗兔IgG至包被膜：用喷膜仪分别将选定浓度的包被原CAP-OVA喷载于包被膜的T线，以及羊抗兔IgG喷载于包被膜的C线上，37℃烘箱干燥10min备用；

5)检测试纸条的制作：将样品垫、磁标CAP抗体的结合垫、包埋包被原CAP-OVA和羊抗兔IgG的包被膜、吸水垫依次衔接在衬板上，组成氯霉素免疫磁珠层析检测试纸条；

6)样品检测：将检测试纸条样品垫插入待测样品溶液，样品将通过层析作用从试纸条上流过，10～20秒后取出试纸条，再于室温下反应15分钟后，将测试板放入Enviso^TM System的Magnetic Assay Reader进行检测，此检测仪将已经转化成磁场信号的生物学反应信号进一步以电信号方式输出；绘制标准曲线后，依据标准曲线求出待测样品的含量。

3、根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的免疫磁珠的制备：将CAP多克隆抗体与纳米磁珠偶联，制备含CAP抗体的免疫磁珠：吸取适量磁珠至小试管中，离心使磁珠与贮存液分离，去除贮存液并加入乙磺酸MES清洗缓冲液涡旋和超声清洗并离心，重复几次，最后重悬磁珠，将一定体积的新鲜配置的水溶性碳化二亚胺EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS加入磁珠悬液中活化羧基，使磁珠表面羧基与EDC和NHS的摩尔比为1∶4∶3，涡旋混合后于室温低速搅拌孵育反应2小时，分别用MES清洗缓冲液及硼酸清洗缓冲液清洗磁珠，随后将CAP抗体缓慢滴加入磁珠悬液中低速搅拌孵育反应过夜，再逐滴加入质量浓度5％BSA，使BSA的终浓度为1％，持续搅拌5min，以饱和游离的磁珠；低速离心去除凝聚的磁珠沉淀，然后再用硼酸清洗缓冲液清洗磁珠去除未结合的蛋白质，将磁珠转移至新管，弃掉硼酸清洗缓冲液，并用偶联缓冲液重悬浮，放4℃冰箱存放；用时则用定量加样装置将已经标记有CAP抗体的磁珠加入磁标结合垫，并放入37℃烘箱干燥10min备用组成检测试纸条。