[发明专利]一种快速检测氯霉素的免疫磁珠层析试纸条及其制备方法

说明书

技术领域

一种快速检测氯霉素的免疫磁珠层析试纸条及其制备方法，涉及氯霉素检测技术领域。

背景技术

氯霉素(Chloramphenicol，简称CAP)是第一个全化学人工合成的抗生素，由于其价廉及优良的抗菌性、稳定的药性，曾在一段时间内作为饲料添加剂和细菌性疾病的治疗用药，使用范围较广。氯霉素是一种广谱抗生素，大剂量反复使用会造成CAP在牛奶及奶制品等中残留。氯霉素对胃、肠、肝脏等有一定的蓄积损害作用，还会造成过敏反应、二重感染、致畸胎，并易引起人体血中毒，导致不可逆的再生障碍性贫血。因此各国对食品中氯霉素残留量都制定了严格的限制标准。氯霉素残留问题已引起国际组织和世界上许多国家和地区的高度重视。欧盟、美国等均在法规中规定氯霉素残留限量标准为“零容许量”，即不得检出。我国政府规定禁止在渔牧养殖中使用氯霉素，并加强了对动物源性食品中氯霉素残留的检测力度。目前我国采用的氯霉素药物残留的检测方法有微生物法、毛细管区域电泳法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱法、液相色谱-质谱法等，但是上述分析方法都有如下缺点：一连串物理或化学操作会破坏样品；样品须经多步稀释、过滤、提取，制备复杂、繁琐。气质联用或者液质联用是氯霉素的确证方法，但是由于其操作繁琐，以及长时间的样本前处理和还原过程，导致检测成本高，周期长，无法满足大批量样本快速筛查的要求，而使其广泛使用受到限制。免疫分析技术具有较高的灵敏度和特异性，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的检测。酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked Immuno-sorbent Assay，简称为ELISA)和胶体金免疫层析法(Colloidal Gold Irnmuno-Chromatography Assay，简称为GICA)由于其廉价、特异、灵敏和快速等特点，被广泛地使用于兽药残留的快速筛查中。但ELISA试剂需要专用的实验室和专业人员进行检验，操作复杂，时间较长；胶体金类试剂操作简便、快速、适于现场检测，但灵敏度稍低，结果用肉眼直接观察，会产生误差，亦不能记录。

纳米免疫磁珠是含有铁元素的超顺磁纳米颗粒，外面包覆着聚乙烯类高分子物质，并可带有羧基或氨基，用于和蛋白质分子交联。免疫磁珠在细胞和大分子分离、纯化及诊断上都已得到应用。

纳米免疫磁珠检测试纸基本原理如下：采用竞争法，即样品中的氯霉素CAP和固定在包被膜上的包被抗原CAP-OVA竞争磁珠标记的氯霉素多克隆抗体。

利用免疫磁珠标记一种抗体，在试纸的NC膜上包被相应的包被抗原和羊抗兔二抗。当试纸条以样品垫末端浸入样本后，样品溶液沿着试纸条通过毛细管作用从下往上泳动，溶解磁标垫上干燥的磁标抗体，若待测样品中不存在待测药物，则磁标抗体会直接泳动到检测线(T线)和硝酸纤维膜上的包被原CAP-OVA发生免疫反应，从而使磁珠颗粒发生聚集，形成黑色的线条，然后其它未结合的磁标抗体继续通过毛细管作用向前泳动，与控制线(C线)上的羊抗兔二抗发生第二次免疫反应，同样形成黑色线条，这样包被膜上就会有两条黑色线条，表示样品为阴性。若待测样品中存在待测药品，则磁标抗体首先会和样品中的检测物发生免疫反应，当未发生反应的磁标抗体有剩余时，才会在检测线上与CAP-OVA发生免疫反应，形成黑色线条，其颜色强度弱于阴性时的线条强度；而当磁标抗体全部和样品中的待测药品氯霉素CAP发生免疫结合时，就不会再有抗体与检测线包被原结合，从而检测线就不会有黑色线条出现。控制线是为检验磁标免疫层析方法本身是否有效而设定的，所以无论样品中是否存在待测药物氯霉素CAP，控制线都应该显现。如果控制线不显色，则说明试纸条失效。最后通过测定检测线上捕获磁珠的含量实现结果的判定。和胶体金试纸类相比，免疫磁珠检测试纸最大的不同在于将标记胶体金改为标记磁珠，检测结果时用Magnetic Assay Reader对检测线上的磁珠含量进行检测并把磁信号转变为电信号，而不是依靠肉眼去总判定，这样可使得结果判定更为精确、灵敏、客观和便于记录保存。利用纳米免疫磁珠研制氯霉素抗体检测快速诊断试纸尚无报道。

发明内容

本发明的目的：针对现有检测氯霉素CAP的技术的不足和缺陷，提供一种基于纳米磁免疫技术的、灵敏度高、反应时间短、仪器设备便宜的可快速检测氯霉素的检测方法，使其能更加快速、灵敏、简便地检测动物中氯霉素的兽药残留。