[发明专利]一种用于高蛹虫草生物量和高虫草素含量的发酵方法

说明书

一、技术领域

本发明为一种用于高蛹虫草生物量和高虫草素含量的发酵方法，将现代生物调控技术应用于蛹虫草深层液体发酵，专用于富含虫草素的蛹虫草菌丝生产，属于生物工程技术领域。

二、背景技术

蛹虫草在我国又叫北冬虫夏草，是一种能寄生多种鳞翅目昆虫蛹及幼虫的虫草菌。蛹虫草与冬虫夏草在药化和药理上十分相似，在功能食品、医药和生物技术方面有很好的实用价值。近年国内外生产上市的一些名为冬虫夏草的药品和功能食品，相当部分实际都是用蛹虫草生产的。蛹虫草子实体中最主要的特征性功能成分为虫草素，但研究表明人工培养无性菌丝体中虫草素含量很少。

目前，蛹虫草生产仍以固体栽培为主，因其周期长、劳动强度大、占地多、生产效率低，而且受环境、区域、季节、原材料、易遭病虫害等限制，产量与质量不稳定。

随着液体深层发酵技术的发展，已对许多大型真菌进行大规模培养，而液体深层发酵技术具有生产工艺简便、材料易得、占地少、周期短、所得产品质量好且稳定、生产效率高、容易控制等优点；同时利用深层培养技术在短时间内培养出大量的菌丝体，既可作为具有纯度高、活力强、繁殖快的液体菌种，使生产原种和栽培种的时间大大缩短，能使工厂大规模生产，为集约化、标准化创造有利条件，具有广阔的前景。因此，如果能通过液体发酵、加以调控技术获得富含虫草素的虫草发酵菌粉产品，将会产生很大的经济效益。

内生真菌是一类非常特殊的真菌，它们生活在植物组织内部，具有独特的生物学和遗传学系统，能产生具有多种生物活性的新型化合物，在作为真菌诱导子方面具有很大的优势。本发明从银杏中分离内生真菌，从中筛选一株对蛹虫草生长和虫草素积累具有显著促进作用的菌株，同时结合培养基优化和无机盐诱导，获得了一种能显著提高蛹虫草发酵生物量和菌体中虫草素含量的方法。

三、发明内容

技术问题  本发明的目的是提供一种用于高蛹虫草生物量和高虫草素含量的发酵方法，实现蛹虫草发酵菌粉的规模化、标准化高效生产，富含特征性成分虫草素，产品质量稳定。

技术方案  本发明所提供一种用于高蛹虫草生物量和高虫草素含量的发酵方法，包括：

1)生物型诱导子的制备：本研究室斜面保存的一株炭角菌属银杏内生真菌(Xylariasp.)YX-28，接种到PDA液体培养基中，PDA液体培养基为：土豆200g、葡萄糖20g、水1000mL、pH自然，25℃、120rpm黑暗培养7d。将培养物反复冻融3次后，在冰浴条件下于超声波细胞破碎仪中1200W、5min(超声时间5s、间隔时间3s)处理，10000rpm离心10min，收集上清冷冻干燥，制成20mg/mL的储备溶液，最后经0.22μm滤膜过滤除菌。

2)非生物型诱导子制备：称取乙酸钠、硫酸铵，以70％甲醇水溶液溶解，配制成浓度分别为0.07mol/L、0.056mol/L的混合溶液，经0.22μm滤膜过滤除菌。

3)菌种活化：将PDA斜面保存的蛹虫草(Cordyceps militaris)菌种接种到液体培养基(土豆200g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾0.5g、硫酸镁1g、维生素B₁0.01g、水1000ml)中活化，黑暗条件下、20℃、摇床120rpm振荡培养5天。

4)蛹虫草发酵培养基的组成：按糖蜜20g/L、玉米浆干粉10g/L、氯化钙0.25g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L称取各组分，以水溶解。

5)10L一级种子罐培养：按照4)所述培养基配方，以7L体积计称取所需各组分，并按2‰比例(体积比)添加消泡剂，以2-3L水溶解后加入种子罐中，121℃蒸汽灭菌15min，控制灭菌后培养基体积为罐容积的60％；培养基冷却后，采用火圈接种法将活化好的菌液按体积比10％接种到种子罐中，种子罐温度20℃，搅拌速率100rpm，无菌空气流量0.75vvm，罐压0.1Mpa，培养3天；

6)100L发酵罐培养：按照4)所述培养基配方，以70L体积计称取所需各组分，并按2‰比例(体积比)添加消泡剂，以40L水溶解后加入发酵罐中，121℃蒸汽灭菌15min，控制灭菌后培养基体积为罐容积的60％。培养基冷却后，通过压差法将种子罐中的种子液由专用管道转移到发酵罐中，20℃，搅拌速率100rpm，无菌空气流量0.75vvm，罐压0.1Mpa，培养96h后由补料口加入步骤1)中所述生物型诱导子过滤除菌的银杏内生真菌提取物，使终浓度为120μg/mL；继续培养，120h后由补料口加入步骤2)中所述非生物型诱导子至乙酸钠、硫酸铵的终浓度分别为0.5mmol/L、0.4mmol/L，继续培养至8天终止发酵。