[发明专利]具有高产α-环糊精能力的环糊精葡萄糖基转移酶的突变体及突变方法

权利要求书

1.来源于软化类芽孢杆菌(Peanibacillus macerans)JFB 05-01的环糊精葡萄糖基转移酶的单突变体酶D372K的制备方法，其特征是：

(1)定点突变

利用快速PCR技术，以表达载体cgt/pET-20b(+)为模板，

引入D372K密码子的定点突变引物为：

正向引物：5’-GACCGGCGATGGCAAACCCAACAACC-3’，下划线为突变碱基，

反向引物：5’-GGTTGTTGGGTTTGCCATCGCCGGTC-3’，下划线为突变碱基，

PCR反应体系为：10×Ex Taq buffer 5μL，2.5mM dNTPs 5μL，10μM正向引物1μL，10μM反向引物1μL，模板DNA 1μL，5U/μL Ex Taq HS 0.25μL，加入双蒸水至50μL；

PCR扩增条件为：94℃预变性4min；随后进行94℃30s，55℃30s，72℃6min 35个循环；最后72℃保温10min；

PCR产物经Dpn I消化，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，感受态细胞在含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基培养过夜后，挑单克隆于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，后提取质粒，将突变质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，突变质粒测序正确；

(2)突变体的表达与纯化：

挑取转入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)的单克隆于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基生长8～10h，按4％接种量将种子发酵液接到含100μg/mL氨苄青霉素的TB液体培养基；大肠杆菌在30℃摇床培养至OD₆₀₀＝0.6，加入0.01mM终浓度的IPTG诱导胞外表达，并在25℃摇床继续培养发酵90小时后，将发酵液于4℃、10000rpm离心20min除菌体，收集上清液并纯化，得到突变体酶D372K制品。

2.来源于软化类芽孢杆菌(Peanibacillus macerans)JFB 05-01的环糊精葡萄糖基转移酶的单突变体酶Y89D的制备方法，其特征是：

(1)定点突变

利用快速PCR技术，以表达载体cgt/pET-20b(+)为模板，

引入Y89D密码子的定点突变引物为：

正向引物：5’-CTCCGTCATCAAGGATTCCGGCGTTA-3’，下划线为突变碱基，

反向引物：5’-TAACGCCGGAATCCTTGATGACGGAG-3’，下划线为突变碱基，

PCR反应体系为：10×Ex Taq buffer 5μL，2.5mM dNTPs 5μL，10μμM正向引物1μL，10μM反向引物1μL，模板DNA 1μL，5U/μL Ex Taq HS 0.25μL，加入双蒸水至50μL；

PCR扩增条件为：94℃预变性4min；随后进行94℃30s，55℃30s，72℃6min 35个循环；最后72℃保温10min；

PCR产物经Dpn I消化，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，感受态细胞在含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基培养过夜后，挑单克隆于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，后提取质粒，将突变质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，突变质粒测序正确；

(2)突变体的表达与纯化：

挑取转入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)的单克隆于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基生长8～10h，按4％接种量将种子发酵液接到含100μg/mL氨苄青霉素的TB液体培养基；大肠杆菌在30℃摇床培养至OD₆₀₀＝0.6，加入0.01mM终浓度的IPTG诱导胞外表达，并在25℃摇床继续培养发酵90小时后，将发酵液于4℃、10000rpm离心20min除菌体，收集上清液并纯化，得到突变体酶Y89D制品。