[发明专利]具有高产α-环糊精能力的环糊精葡萄糖基转移酶的突变体及突变方法

说明书

技术领域

具有高产α-环糊精能力的环糊精葡萄糖基转移酶的突变体及突变方法，本发明属于基因工程和酶工程领域。具体地说本发明是利用蛋白质工程的定点突变方法改善环糊精葡萄糖基转移酶(CGT酶)的产物特异性的技术。 

背景技术

环糊精是由六个以上葡萄糖连结而成的具有环状疏水圆锥形结构的低聚糖非还原性化合物系列，其中最常用的是α-、β-、γ-环糊精，它们分别由6、7、8个葡萄糖单元构成。目前，环糊精的工业化生产均采用酶法合成，即在CGT酶催化作用下，通过环化反应转化淀粉及相关基质合成环糊精。由于环糊精能与许多客体分子形成包合物，从而改变客体分子的物理和化学性质如溶解度、稳定性等，因此在食品、医药、农业等领域具有广泛的应用。 

CGT酶是一个多功能型的酶，它能催化四种不同的反应：三种转糖基化反应(歧化反应、环化反应和偶合反应)和水解反应。CGT酶通过环化反应能利用淀粉生产环糊精，这是其工业应用的基础。用CGT酶生产环糊精一个主要的不利条件是所有已知的野生型CGT酶生产的是α-、β-、γ-环糊精的混合物。这不仅给产物的分离纯化带来很大不便，而且提高了生产成本。目前，两种工艺可以用于从环糊精混合物中纯化单一的环糊精：β-环糊精的选择性结晶(β-环糊精溶解度相对低)和有机溶剂选择性络合。α-环糊精一般用癸醇，但这个化合物很难从水溶液中去除，因为其沸点高达229℃；一般用环十二酮对γ-环糊精进行络合和选择性沉淀，但是这个溶剂对于商业使用来讲太贵，而且，有机溶剂使用的不利因素还包括它们的毒性和可燃性以及需要溶剂回收工艺，因此，目前α-、γ-环糊精的利用很大程度上受到限制。即使是β-环糊精的生产工艺也不是很理想，因为对于大多数应用来讲，目前工艺使β-环糊精的生产成本还是太高。因此，如果所得到CGT酶所生产的环糊精中某一种特定的环糊精比例大大增高，那么就可以避免上述成本太高和有机溶剂污染等问题。 

本发明所使用的来源于Peanibacillus macerans JFB 05-01(CCTCC NO：M208063)的CGT酶虽然在酶转化反应初期主要生产α-环糊精，但后期α-环糊精的含量偏低，在未使用有机溶剂的情况下，反应混合液中β-环糊精的含量甚至高于α-环糊精，因此，进一步提高该酶的产α-环糊精能力对工业上α-环糊精的生产是相对有利的。 

发明内容 

本发明的一个目的是提供提高P.macerans JFB 05-01 CGT酶产α-环糊精能力的突变方案。 

本发明的另一个目的是提出具有更高α-环糊精生产能力的突变体酶D372K，Y89D，Y89R及D372K/Y89R，及其构建方法。 

本发明的技术方案： 

来源于软化类芽孢杆菌(Peanibacillus macerans)JFB 05-01的环糊精葡萄糖基转移酶，简称CGT酶，的三种单突变体酶D372K，Y89D及Y89R：将CGT酶基因中第372位的天冬氨酸Asp突变成了赖氨酸Lys，命名为D372K；将CGT酶基因中第89位的酪氨酸Tyr分别突变成了天冬氨酸Asp或精氨酸Arg，分别命名为Y89D及Y89R；它们相比于野生型CGT酶具有更高的产α-环糊精能力。 

三种单突变体酶D372K，Y89D及Y89R的制备方法，根据P.macerans JFB05-01CGT酶基因序列，分别设计并合成引入D372K，Y89D或Y89R突变的引物，对CGT酶基因进行定点突变，测定DNA序列，分别鉴别出第372位Asp密码子变成Lys密码子，第89位Tyr密码子分别变成Asp或Arg密码子的突变体，并进行大肠杆菌表达。 

P.macerans JFB 05-01 CGT酶的一种双突变体酶D372K/Y89R：将单突变体酶D372K基因中第89位的酪氨酸Tyr突变成了精氨酸Arg，命名为D372K/Y89R，其相比于野生型CGT酶具有更高的产α-环糊精能力。 

一种双突变体酶D372K/Y89R的制备方法，以单突变体酶D372K基因为模板，设计并合成引入Arg密码子于89位的定点突变引物，对D372K基因进行定点突变，测定序列，鉴别出89位的Tyr突变成Arg的突变体，并进行大肠杆菌表达。 

所述的突变体酶D372K，Y89D，Y89R及D372K/Y89R的制备： 

(1)定点突变 

单突变体酶D372K，Y89D和Y89R的定点突变：利用快速PCR技术，以表达载体cgt/pET-20b(+)为模板， 

引入D372K密码子的定点突变引物为：