[发明专利]栽培水稻成熟胚高频植株再生方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种栽培水稻成熟胚高频再生植株的技术方法，属于生物技术领域，普遍适用于不同的籼稻、粳稻和杂交稻等基因型栽培水稻成熟胚的组织培养、体细胞突变体筛选及农杆菌介导法基因转化。

背景技术

近年来，由于人口的增加，耕地的减少，对作为全球一半以上为主食的水稻单产增加的需求更加迫切，但实际上，我国由于矮杆基因和杂种优势利用的广泛应用，水稻育种已取得了很大成就，再通过常规育种改良水稻的空间越来越小。今后迫切需要采用更高效新技术新思路来创造新种质。

20世纪80年代以来，水稻愈伤组织培养技术在单倍体育种，远缘杂交育种和离体受精等方面得到了广泛的应用[章志宏，胡中立.水稻单倍体不定芽超低温保存和植株再生及其遗传稳定性研究[J].武汉植物研究，2000，18(3)P.169-173；王爱云，陈冬玲，蔡得田.远缘杂交和异源多倍体化技术在水稻育种中的应用[J].武汉植物研究，2005，23(5)P.491-495；王忠安禾本科植物离体受精技术[J]生物学通报，2005，40(10)P.1-2]，它可以打破物种的界限进行基因转移，增加遗传多样性。从1988年获得第一批转基因水稻至今，已将大量的水稻基因库中不具有的抗除草剂、抗虫、抗病、抗病毒、耐盐、改善稻米品质等基因引入水稻细胞中，获得系列新的种质资源，可见水稻生物技术越来越成为现代水稻育种的新兴的重要的技术手段。

利用水稻成熟胚进行组织培养具有水稻品种来源广，取材不受季节和地理环境限制，而且接种操作方便，不易染菌等很多优点，因而水稻成熟胚是水稻组织培养首选的外植体。影响水稻胚性愈伤组织形成和植株再生能力的因素包括基因型、外源激素、渗透压、外植体来源、固化剂、培养基其它成份以及温度、光周期和继代时间等多个方面，其中材料的基因型、外源激素的种类、浓度和配比是最主要的因素[李霞，陈婷，周月兰.籼粳稻成熟胚愈伤组织培养力的比较[J].南京师大学报，2005，28(4)P.103-108]。现阶段，水稻成熟胚组织培养技术还是利用不同品种对外源激素的敏感性的不同而研制出一一对应的愈伤组织诱导的独特培养基配方，才可能进一步用于水稻的生物技术育种和基因工程研究，而通常这个培养基研制的过程需要半年甚至更长的研制时间[陈璋，继代培养对水稻胚性愈伤组织染色体变异及体细胞无性变异的影响福建农学院学报1993，22(3)P.274-279]。现在所报道的培养方法和配方都是不同的，而且是选用的试剂都比较昂贵，应用到大规模水稻改良还有相当距离。如王萍等[王萍，徐大勇，王罡等粳籼稻两个亚种成熟胚组织培养与再生能力的比较研究[J].种子P.66-67]研究了8个生产上大面积栽培的粳稻基因型和5个杂交籼稻亲本基因型进行愈伤诱导率与苗分化率的研究，采用以N6为基本培养基，附加2，4-D 1～2mg/L的诱导培养基，结果粳型水稻愈伤诱导率变化在85.71～100％，苗分化率为20～63.33％，籼型水稻愈伤诱导率在85.71～91.43％之间，但5种籼型水稻基因型苗分化率较低，仅为0～26.42％，而恢056没有诱导分化苗。张玲等[张玲，谢崇华，李卫锋水稻成熟胚组织培养研究[J].杂交水稻.2002，17(2)P.44-46]以粳稻品种H1493和中花11以及籼稻品种珍汕97B和明恢63为研究对象，在只加2mg/L 2，4-D.蔗糖4.5％、琼脂粉O.75％；分化培养基为MS培养基附加KT 2mg/L、NAA O.5ml/L、蔗糖3％、琼脂粉0.75％。其粳稻再生率分别为90.0％和66.7％，籼稻再生率几乎为0，李霞等[李霞，陈婷，周月兰.籼粳稻成熟胚愈伤组织培养力的比较[J].南京师大学报，2005，28(4)P.103-108]用粳稻9908和籼稻扬稻6号进行研究，以M8为基本培养基，激素配比为1mg/L 2，4-D、2mg/L ABA、2mg/L6-BA的培养基可以使籼稻扬稻6号的成愈率达到90.5％；激素配比为1mg/L 2，4-D的培养基可以使粳稻9908的成愈率达到88.2％；以MS为基本培养基，激素配比为0.2mg/L 2，4-D、2mg/L 6-BA、2mg/L KT的培养基使扬稻6号和粳稻9908愈伤组织的植株再生分别达到65.4％和62.7％；黄赛麟等[黄赛麟，李东宣，甘树仙，朱建荣，李娟，梁晶，陈丽娟，水稻成熟胚培养高效再生系统的创新分子植物育种，2008，6(4)P.801-806]在改良培养基N6I愈伤诱导、MSR绿苗分化和MSC生根条件下，籼稻滇屯502、粳稻日本睛、籼粳杂种F1(滇屯502/日本晴)和非洲栽培稻(RG105)诱导率分别为96％、100％、98％和100％，成苗率也非常高，但是否适合其他水稻类型还不清楚。实际上，上述报道的水稻成熟胚再生技术从水稻的品种、基本培养基，激素的比率，碳源的种类和浓度等都不同，甚至相同的水稻材料在不同的培养方法中所得结果的差异也非常大，可见，现有水稻成熟胚再生技术对基因型的依赖仍较强，实际上目前很难参照一套通用的完整组织培养系统来得出理想的再生效果。尤其是上述研究所使用的碳源都是选择蔗糖、葡萄糖和麦芽糖等单一碳源，成本普遍偏高，应用于规模化的水稻生物技术育种还有一定距离，而使用廉价的市售的复合碳源白砂糖作为碳源可以得到和单一碳源相同效果的研究报道尚未见到。而且上述报道中整个诱导愈伤组织的诱导多在暗箱中培养，虽然诱导率很高，但是多生成浸润的白色的愈伤组织，不利于胚性愈伤组织的生成，造成不同水稻品种分化率差异很大，严重影响其后分化的效果稳定性。