[发明专利]草莓角斑病菌的检疫鉴定方法

权利要求书

1、一种草莓角斑病菌的检疫鉴定方法，其特征及步骤如下：

(1)现场检疫：检查草莓苗叶和茎有无病变症状，当在草莓叶面上发现水渍状红褐色不规则形病斑、叶背溢出菌脓或植株生长点变黑的可疑症状时，取样；在产地检疫和隔离试种期间，还要注意检查有无淡红褐色干枯病叶或生长点死亡的植株，当发现可疑症状时，取样；

(2)病原菌分离纯化：取步骤(1)抽取的病叶，用70％的乙醇进行表面消毒，切取病健交界处，无菌水冲洗后碾碎，置于PBS缓冲溶液中10min～15min；在无菌操作条件下吸取稀释液均匀涂布于WILBRINK-N培养基平板上，置于25℃培养5d～7d，然后再进行三次的纯化，最后获得纯菌株；

(3)病原菌形态观察及生理生化测定：a形态观察：对分离纯化获得的纯菌株，经染色制成玻片，在显微镜下观察形状，测量大小；b菌落颜色：将纯菌株在WILBRINK-N或YPGA培养基上划线培养，置于25℃培养5d～7d，观察菌落的颜色和形状；c生理生化测定：采用GB/T4789.28中革兰氏染色法和鞭毛染色法进行；

(4)致病性测定：将WILBRINK-N或YPGA培养液中培养3d～5d的菌株，用PBS缓冲溶液稀释到10⁹cfu/ml，选取完全健康的草莓感病品种，用蘸取悬浮液的接种针小心地扎刺新生叶面，每片叶扎刺5次～10次，设置五个重复，以PBS缓冲溶液为对照；接种后用塑料袋罩住植株，使植株置于20℃～25℃、相对湿度≥80％的隔离温室里生长4个星期，每天观察并记录发病情况，出现症状后，用步骤(2)所述方法进行病原菌再分离、纯化；

(5)PCR法检测：采用PCR凝胶电泳检测，方法如下：

病原细菌DNA的提取：

取待测样品或分离培养菌株，利用DNA提取试剂盒方法提取DNA，并测定DNA浓度，-20℃保存备用；也可直接用培养的菌株稀释悬浊液作为模板进行PCR反应；

阴性对照、阳性对照和空白对照的设置：

阴性对照：以待测健康的草莓叶片DNA为模板；阳性对照：采用草莓角斑病菌或含有待测基因序列的质粒；空白对照：设两个，一是提取DNA时设置的提取空白对照，二是PCR反应的空白对照；

琼脂糖凝胶电泳：

制备2％的琼脂糖凝胶，用DNA Marker作为分子量标记，进行电泳分析，电泳结束后在凝胶成像仪的紫外透射光下观察并拍摄记录；

结果判断：若有537bp大小的产物带出现，可判定为阳性。

2、根据权利要求1所述的草莓角斑病菌的检疫鉴定方法，其特征在于，步骤(2)所述方法得到的纯菌株的保存方法为：将纯菌株转接到WILBRINK-N或YPGA培养基斜面上，25℃恒温培养5d～7d；然后置于4℃冰箱中保存，30d～60d定期转接，防止病菌死亡；或者将纯菌株用真空冷冻干燥机制成冻干粉，-80℃下长期保存。