[发明专利]草莓角斑病菌的检疫鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种病菌的检疫鉴定方法，特别是草莓细菌性角斑病菌的检疫鉴定方法。

背景技术

草莓角斑病(Angular leaf spot of strawberry)病原菌为草莓角斑病菌(Xanthomonas fragariae Kennedy&King)，该菌属于原核生物界(Procaryote)，薄壁细菌门(Gracilicutes)，暗细菌纲(Scotobacteria)，假单胞杆菌科(Pseudomonadaceae)，黄单胞杆菌属(Xanthomonas)。

草莓角斑病菌的寄主范围：草莓(Fragaria ananassa)是该病原菌的主要寄主。病原菌对草莓属(Fragaria)的其它品种的致病性变化较大。人工接种情况下，弗州草莓(F.virginiana)、野草莓(F.vesca)、金露梅(Potentilla fruticosa)和委陵菜(P.glandulosa)均可被草莓角斑病菌侵染。草莓属植物中仅麝香草莓(F.moschata)对草莓角斑病菌免疫。

草莓角斑病菌的生物学特性是：病叶残渣和带菌植株是发病的初次侵染源。在病残叶和土壤中，病菌能够存活到下茬作物；在实验室保存的干燥病叶片中，病原菌至少可存活两年半。在草莓开始生长时，病原菌由病残叶传播到幼叶上，细菌可从侵染区沿着幼叶基部叶脉扩散，在田间传播主要靠雨水、喷灌及风的作用传播。病原菌可通过气孔侵入，也可经过局部伤口或下方的病叶侵染，在整个生长期发生多个侵染循环，病菌可侵染植物的花，但不侵染果实。中等偏低的日温(大约20℃)、夜间低温及较高的湿度更有利于该病菌的侵染。

草莓角斑病菌的传播途径：草莓角斑病菌可以通过雨水和田间灌溉飞溅作局部传播、扩散，携带病菌的草莓苗以及夹杂在草莓苗中的病残体都可能随贸易作短距离和长距离的运输传播。

国内对草莓角斑病菌的检疫鉴定方法的研究为空白，而在国外相关的草莓角斑病菌的检疫鉴定方法研究中，虽然进行生物学和分子方法的检疫鉴定研究，但其检疫鉴定方法缺乏系统性和完整性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种准确、高效和快速的草莓角斑病菌的检疫鉴定方法。

本发明是一种进出境植物检疫中草莓角斑病菌Xanthomonas fragariaeKennedy&King的检疫和鉴定方法，适用于进出境草莓种苗中草莓细菌性角斑病菌Xanthomonas fragariae Kennedy&King的检疫和鉴定。

以下对本发明草莓角斑病菌的检疫鉴定方法进行详细阐述。

1、引用文件

GB/T 4789.28-2003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂；

SN/T1157进出境植物苗木检疫规程。

2、原理

病害的症状、病原菌的形态特征、生物学特性、生化特性、致病性测定，以及分子生物学特征是本发明检疫鉴定方法的依据。

3、仪器和用具

生物显微镜、生化培养箱、高压灭菌器、电子天平(感量0.0001)、恒温振荡培养箱、超净工作台、PCR仪、电泳装置、恒温水浴锅、高速冷冻离心机、移液器、移液器枪头、研钵、量筒、烧杯、培养皿、PCR管、离心管、接种针、玻璃棒、剪刀等。

4、主要试剂

蛋白胨、酵母膏、蔗糖、葡萄糖、琼脂粉、冰乙酸、乙醇、乙二胺四乙酸(EDTA)、十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基磺酸钠(SDS)、液氮、酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、琼脂糖(电泳用)、溴化乙锭(EB)、Taq DNA聚合酶、氯化钾(KCl)、磷酸氢二钾(K₂HPO₄)、氯化钠(NaCl)、磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)、氯化镁(MgCl₂)、硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)、硝酸钠(NaNO₃)、乙二胺四乙酸钠(Na₂EDTA)、溴酚蓝、蛋白酶K、RNase A、10×PCR缓冲液、dNTP(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)。

5、检疫鉴定方法

5.1现场检疫

抽样数按SN/T 1157中规定的方法进行。

在现场检疫时，应仔细检查草莓苗叶和茎有无病变症状，如在草莓叶面上发现水渍状红褐色不规则形病斑、叶背溢出菌脓、植株生长点变黑等可疑症状时，应取样作实验室鉴定。