[发明专利]饲料用β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因工程菌及其构建

权利要求书

1、一种饲料用β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因工程菌，其分类命名为大肠杆菌BL21/pET 30 a-HAM，己保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO：M 209067。

2、权利要求1所述CCTCC NO：M 209067的基因，其核苷酸序列为SEQ IDNO：1。

3、根据权利要求2所述的基因，其特征是该基因是由淀粉液化芽孢杆菌和浸麻芽孢杆菌中的β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因以基因重叠延伸技术拼接杂合形成具有β-1，3-1，4-葡聚糖酶活性的杂合基因。

4、根据权利要求2或3所述的基因，其特征是杂合基因由淀粉液化芽孢杆菌中的β-1，3-1，4-葡聚糖酶的信号肽和成熟肽N-端15个氨基酸残基的编码子替代浸麻芽孢杆菌中的β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因相应部分形成的杂合基因；

所述的相应部分为浸麻芽孢杆菌中的β-1，3-1，4-葡聚糖酶的信号肽和成熟肽N-端15个氨基酸残基的编码子。

5、权利要求1所述基因工程菌CCTCC NO：M 209067的构建，其特征是：

(1)合成杂合基因：

以淀粉液化芽孢杆菌的基因组为模板、用引物1和引物2进行PCR扩增，获得淀粉液化芽孢杆菌的β-1，3-1，4-葡聚糖酶的信号肽和成熟肽N-端15个氨基酸残基的编码子，命名为基因A；

以浸麻芽孢杆菌的基因组为模板、用引物3和引物4进行PCR扩增，获得去除浸麻芽孢杆菌β-1，3-1，4-葡聚糖酶的信号肽和成熟肽N-端15个氨基酸残基的编码子的浸麻芽孢杆菌β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因的剩余部分，命名为基因B；

以基因A和基因B互为引物互为模扳进行PCR扩增，获得杂合基因HAM；

合成杂合基因的引物是：

引物1：5′-AGAGGATCCATGAAACGAGTGTGCTTATTCTTGCACtCGGATTGTTTA-3′，

引物2：5′-CGTTATTCGCACGCCAGTGACGTTAAACATATCTCCATT-3′，

引物3：5′-TGGAGGTGTATTATGAAAAAGAAGTCCTGTTTTACACTGGCACTTGGCGT GCGAATAACG-3′，

引物4：ACACTCGAGGACTTATAC TGACCCATTT TATATGTCG-3′，

PCR反应体系：0.5mL PCR管中按顺序加入以下试剂：10×PCR缓冲液5μL，25mmol/L MgCl₂ 1μL，10mmol/L dNTP 1μL，上下游引物各1μL，模板DNA 2μL，Taq酶0.5μL，加双蒸水至总体系50μL；

PCR扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性1min，X℃退火50s，72℃延伸1min，30个循环；然后72℃补充延伸10min，4℃保存；退火温度在扩增基因A时X为50℃，扩增基因B时X为54℃，扩增杂合基因HAM时X为52℃，其余扩增条件相同；

(2)构建基因工程菌：将杂合基因HAM用BamH I和Xho I酶切后连接到大肠杆菌表达载体pET-30a中，得到重组载体pET 30a-HAM，用CaCl₂法将重组载体pET 30a-HAM转化到E.coli BL21中，经蓝白斑筛选，选出阳性重组子，得到重组大肠杆菌基因工程菌：大肠杆菌BL21/pET 30 a-HAM。

6、权利要求1所述大肠杆菌BL21/pET 30 a-HAM所产β-1，3-1，4-葡聚糖酶，其特征是该酶的特性为：最适温度为65℃，在55～80℃条件下孵育20min，酶的活性大于80％，最适pH值7.0，在酸性环境较稳定；酶的比活力为1700U/mg，耐热性和耐酸性均比亲本酶淀粉液化芽孢杆菌酶和浸麻芽孢杆菌酶高。