[发明专利]饲料用β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因工程菌及其构建

说明书

技术领域

本发明涉及淀粉液化芽胞杆菌β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因和浸麻芽孢杆菌β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因的杂合，属于基因工程和蛋白质工程技术领域。

背景技术

β-1，3-1，4-葡聚糖是构成禾本科植物细胞壁的一种非淀粉性多糖，在大麦、黑麦、高梁、大米和小麦的胚乳细胞壁中含量甚高。当β-1，3-1，4-葡聚糖溶解在水中时，随浓度增大，溶液的粘度也增大。在畜牧业中用麦类饲料喂养禽畜时会造成消化液粘度增大，养分吸收效率降低，同时，β-1，3-1，4-葡聚糖可被有害微生物利用，导致病原菌繁殖，增加发病率，甚至会造成某些消化道疾病。通过添加可降解β-1，3-1，4-葡聚糖的β-1，3-1，4-葡聚糖酶(EC.3.2.1.73，以下简称为β-葡聚糖酶)，可以有效消除β-1，3-1，4-葡聚糖的抗营养因子的作用。

长期以来，我国玉米供应不足，制约着我国饲料工业的可持续发展。据报道，2008年我国玉米产需缺口达650亿斤，占玉米总需求的近20％，而且缺口逐年递增。根据我国国情，仅靠增加玉米产量难以弥补此缺口；另外，我国玉米产量南少北多，南方每年都需大量调入玉米，大大增加饲料成本，而大麦在我国南方省区产量较大，价格较低。与玉米的营养价值相比，大麦除能量略低于玉米外，在蛋白质、氨基酸、维生素B族和矿物元素含量均优于玉米。因此，研发适合饲料添加的β-葡聚糖酶具有重要作用。

目前，饲料用β-葡聚糖酶主要由枯草芽抱杆菌(B.subtilis)和淀粉芽抱杆菌(B.amyloliquefaciens)高产菌株生产。来源于这些菌株的酶耐热性较差，难以经受饲料制粒温度(75～90℃，调质时间为1～2min)、运输和贮存中的高温环境，致使酶活性大幅下降。同时，由于酶的主要作用场所是胃和小肠，要求酶的耐酸性较好。浸麻芽孢杆菌是已知的在中性条件下最耐热的杆菌酶，最适温度为65℃，75℃时仍有80％的活性，但该酶在酸性条件下酶活性较小。而淀粉液化芽孢杆菌酶在酸性条件下，几乎不受影响，但酶的耐热性较低。为了满足β-葡聚糖酶在饲料工业应用的要求，缓解玉米供需压力，开发大麦等谷物饲料资源，采用基因重叠延伸技术，将浸麻芽孢杆菌和淀粉液化芽孢杆菌β-葡聚糖酶基因的不同部分杂合，以期实现饲料用酶的要求。

发明内容

本发明的目的：构建一株可产酸性条件下耐热的β-葡聚糖酶重组大肠杆菌，并提出构建的具体方法。为开发大麦等谷物饲料利用，提高β-葡聚糖酶品质，降低生产成本有重要意义。

本发明的技术方案：一种饲料用β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因工程菌，其分类命名为大肠杆菌BL21/pET 30a-HAM，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 209067。

所述CCTCC NO：M 209067的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

所述的基因，该基因是由淀粉液化芽孢杆菌和浸麻芽孢杆菌中的β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因以基因重叠延伸技术拼接杂合形成具有β-1，3-1，4-葡聚糖酶活性的杂合基因。

所述的基因，杂合基因由淀粉液化芽孢杆菌中的β-1，3-1，4-葡聚糖酶的信号肽和成熟肽N-端15个氨基酸残基的编码子替代浸麻芽孢杆菌中的β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因相应部分形成的杂合基因；

所述的相应部分为浸麻芽孢杆菌中的β-1，3-1，4-葡聚糖酶的信号肽和成熟肽N-端15个氨基酸残基的编码子。

所述基因工程菌CCTCC NO：M 209067的构建，

(1)合成杂合基因：

以淀粉液化芽孢杆菌的基因组为模板、用引物1和引物2进行PCR扩增，获得淀粉液化芽孢杆菌的β-1，3-1，4-葡聚糖酶的信号肽和成熟肽N-端15个氨基酸残基的编码子，命名为基因A；

以浸麻芽孢杆菌的基因组为模板、用引物3和引物4进行PCR扩增，获得去除浸麻芽孢杆菌β-1，3-1，4-葡聚糖酶的信号肽和成熟肽N-端15个氨基酸残基的编码子的浸麻芽孢杆菌β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因的剩余部分，命名为基因B；

以基因A和基因B互为引物互为模扳进行PCR扩增，获得杂合基因HAM；

合成杂合基因的引物是：

引物1：5′-AGAGGATCCATGAAACGAGTGTGCTTATTCTTGCACtCGGATTGTTTA-3′，

引物2：5′-CGTTATTCGCACGCCAGTGACGTTAAACATATCTCCATT-3′，