[发明专利]用RNA干涉降低杨树木质素含量的方法

权利要求书

1.一种用RNA干涉降低杨树木质素含量的方法，从杨树中克隆CCR基因片段作为RNA干扰片段，以组成型启动子CaMV35S启动表达，构建含CCR基因正反片段的表达载体，用根癌农杆菌介导，将CCR基因的正反结构转入杨树中，通过抗性植株PCR检测和对转基因杨树进行Klason木质素和综纤维素含量检测，植株纤维长宽比及细胞壁厚度和组织化学染色测定，检验目的基因的整合情况和表达情况，获得了Klason木质素含量降低和综纤维素含量提高的转基因杨树植株，主要包括以下步骤：

(1)根据杨树木质素合成途径中关键酶CCR基因的序列，通过序列比对，确定杨树木质素合成酶基因的特异性RNA干扰序列，根据干涉序列设计引物，进行杨树木质素合成关键酶CCR基因的干涉片段的特异性扩增；

(2)以组成型启动子CaMV35S启动表达，构建含CCR基因正反片段的植物表达载体；

(3)转化含有目的干涉片段的载体，并将目的干涉片段整合到杨树基因组中；

(4)对抗性植株PCR检测和对转基因杨树进行Klason木质素含量和综纤维素测定以及植株纤维长宽比及细胞壁厚度和组织化学染色测定；

其特征在于：在所述步骤(1)中，通过同源性搜索和序列比对，确定目的基因片段序列为杨树CCR基因的第4个外显子部分序列，即全长CCR基因Genbank Accession Number：AJ295838的第2066～2405片段，共340bp。

2.根据权利要求1所述的用RNA干涉降低杨树木质素含量的方法，其特征在于：在所述步骤(2)中，以组成型启动子CaMV35S启动表达，把CCR基因正反片段置于启动子之后，抑制杨树CCR基因的表达。

3.根据权利要求1所述的用RNA干涉降低杨树木质素含量的方法，其特征在于：在所述步骤(4)中，所述的抗性植株PCR检测是通过设计的CaMV35S特异性引物，进行PCR扩增验证。