[发明专利]用RNA干涉降低杨树木质素含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域的降低杨树Klason木质素含量的方法，尤其涉及一种用RNA干涉降低杨树Klason木质素含量的方法。 

背景技术

纸是人们生活的必需品。目前，世界制浆造纸工业主要以木材为造纸纤维原料，其制浆造纸过程的基本原理是用化学、机械或兼用化学及机械的方法将植物原料中的纤维分离出来，再在浆、水混合的悬浮体中使纤维重新交织成均匀而致密的纸张，而纤维的分离实质上是使纤维中所含木质素取得塑化或溶解的过程。随着经济快速发展和人们生活水平提高，不仅对纸的种类和数量需求越来越大，而且对纸的质量要求越来越高，由于杨树具有速生丰产，适应性强，繁殖容易，纤维长，材质好等特性，成为了我国主要的纸浆用材林树种。近年来，随着产业结构的调整和造纸业的需要，杨树纸浆林栽植面积逐年扩大。然而，在制浆和造纸中除去木质素是一个极大的障碍，原因是木质素很结实，而纤维素很有韧劲，二者很难分开，必须通过剧烈的化学处理工艺将木质素从纤维素中除去。由于林木种内木质素含量变异小，并且变异受环境条件的影响大，利用常规育种方法很难对这一性状进行有效地定向改良，因此，对于林木育种者来说，目标是创造出更有利于制浆工业脱木质素的工程植株，并且其木质素含量降低和或木质素结构改变而植物发育和抗性不受影响。故木质素的遗传改良具有潜在的重要商业价值，降低木材木质素含量或改变木质素结构组成，使得木质素在制浆过程中更易被去除，无论是从提高纸浆得率和质量、降低造纸经济成本还是环境保护方面，都具有重要意义。尤其我国造纸工业污染严重，从源头上治理与减少污染，既可减少能源消耗，又能达到环境保护的目标。 

经过多年的研究，人们对木质素单体的生物合成途径已有了基本框架性认识，普遍认为可分为3个主要途径：(1)由植物光合作用初级产物葡萄糖生成苯丙氨酸，酪氨酸(禾本科植物)和色氨酸等的莽草酸途径；(2)从苯丙氨酸到肉桂酸及其酰基辅酶A酯的苯丙烷类代谢途径；(3)从肉桂酰辅酶A酯还原为木质素单体以及聚合生成木质素的过程称为木质素合成特异途径。 

基因工程改变木质素含量主要是在木质素生物合成途径过程中的关键酶上，主要使用技 术： 

1、正义和反义RNA转基因技术，即是通过导入某个酶基因的正义结构或反义结构，影响细胞内酶的含量或活性，引起目的基因的过量表达或使其表达受抑制，从而达到对木质素结构的控制。刘国道等人利用反义RNA技术，向烟草中导入反向连接的CCoAOMT基因，导致CCoAOMT基因含量和活性下降，进而导致转基因烟草中木质素平均含量降低。同样地利用反义RNA技术，在拟南芥，杨树等植物中也获得了低木质素的转化体。然而反义技术的应用存在一定的局限性，其对内源性基因表达的抑制较弱，往往产生过渡性的表型，会妨碍对目的基因功能的准确判断。其抑制效应遗传稳定性较差，不能稳定可靠地降低目的基因的表达。 

2、基因敲除技术和DNA/RNA嵌合分子介导的基因转变技术，但该方法一次只能研究一个基因，不能有效地对多基因家族进行敲除。一些在动植物发育过程中有关键作用的基因，如果在DNA水平采用基因敲除或突变进行可遗传的修饰，则会过早地基因沉默，产生致死表型，因而无法深入研究。 

发明内容

本发明所解决的技术问题是提供一种用RNA干涉的方法降低杨树木质素的含量，使其用RNA干涉方法抑制杨树木质素合成关键酶CCR基因在杨树中的表达，从而降低杨树木质素含量。 

本发明是通过以下技术方案实现的：一种用RNA干涉降低杨树木质素含量的方法，从杨树中克隆CCR基因片段作为RNA干扰片段，以组成型启动子CaMV35S启动表达，构建含CCR基因正反片段的表达载体，用根癌农杆菌介导，将CCR基因的正反结构转入杨树中，通过抗性植株PCR检测和对转基因杨树进行Klason木质素和综纤维素含量检测，植株纤维长宽比及细胞壁厚度和组织化学染色测定，检验目的基因的整合情况和表达情况，获得了Klason木质素含量降低和综纤维素含量提高的转基因杨树植株。 

用RNA干涉降低杨树Klason木质素含量的方法，主要包括以下步骤： 

(1)根据杨树木质素合成途径中关键酶CCR基因的序列，通过序列比对，确定杨树木质素合成酶基因的特异性RNA干扰序列，根据干涉序列设计引物，进行杨树木质素合成关键酶CCR基因的干涉片段的特异性扩增； 

(2)以组成型启动子CaMV35S启动表达，构建含CCR基因正反片段的植物表达载体； 

(3)转化含有目的干涉片段的载体，并将目的干涉片段整合到杨树基因组中；