[发明专利]一种鼻咽癌EB病毒特异性DNA酶检测试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种鼻咽癌EB病毒特异性DNA酶检测试剂盒。

背景技术

鼻咽癌(Nasopharyngenl Carcinoma，NPC)是发生于鼻咽部的恶性肿瘤，最常见于中国南方，如广东、广西、湖南、福建等省和东南亚一些国家。全世界80％以上的鼻咽癌发生在中国的南方。目前对鼻咽癌尚无确切的一级预防(从病因上预防)措施，因此人们把鼻咽癌的预防寄希望于二级预防上，也即是早发现、早诊断及早治疗。目前，NPC的早期诊断存在较多困难，主要表现在：1)鼻咽解剖部位较深，某些患者由于种种原因无法用间接鼻咽镜进行检查；2)早期鼻咽癌病灶一般较小，容易为临床检查所忽略而造成漏诊。因此临床上迫切需要一种简便，特异性高的检测方法来提早确诊、提高早期诊断率。通过对高发区长期的研究，发现鼻咽癌的自然发展史为：健康人→EB抗体阳性→原位肿瘤→浸润癌。从开始出现症状至死亡平均仅18.7个月，恶性度很高。但鼻咽癌在病理确诊前有较长时间(平均4.36年)，体内的多种EB病毒抗体水平就开始升高，这一现象提示可以通过血清免疫学和生物化学的方法探测鼻咽癌。

针对EB病毒(EBV)某些相关抗体，如：EBV相关的抗原与病毒衣壳抗原(VCA-IgA)、病毒的早期抗原(EA-IgA)、病毒诱导的膜抗原(MA-IgA)等的血清学检测早已应用于鼻咽癌对现场普查、临床诊断、病程追踪。但研究表明如以VCA-IgA作为NPC早期诊断指标或视为癌前可疑指针，则出现较高的假阳性率；而EA-IgA特异性较高但灵敏性差，漏诊可能性大；其它一些抗体如MA-IgA、EBNA-IgA(病毒的核抗原)等灵敏性和特异性都较差，因而寻找其它方法作为NPC辅助诊断的指标就显得非常急需。1980年郑永齐等发现EBV重感染的Raji细胞可以诱导出EBV特异性DNA酶，并证实NPC患者血清中含有高频度和高滴度的该酶抗体(DNA酶中和率，EB病毒特异性DNA酶)。中山大学肿瘤防治中心黄迪教授在此基础上进一步研究发现利用化合物巴豆油和正丁酸可以联合激发原含有EBV基因组的细胞株产生EB病毒特异性DNA酶，酶的活性用¹⁴C标记的同位素方法探测，并证实NPC病人的血清可以明显的降低该酶活性。临床前期研究发现，EBV特异性DNA酶抗体的血清学检测有很高的特异性和灵敏性，可以很好的解决VCA、EA等特异性或灵敏性差的问题，是目前最行之有效的NPC检测方法。

经过多年的研究，基本探明EB病毒特异性DNA酶检测的原理与方法，并试用于临床辅助诊断，但此方法要用到同位素标记DNA(同位素法)。众所周知，同位素发射出来的射线具有一定的能量，它可以破坏细胞组织，从而对人体造成伤害。而且同位素的生产、运输都很不方便，检测步骤烦琐，因此现有的DNA酶检测方法尽管取得较好的临床诊断效果，却没有得到推广，也不容易商品化。

发明内容

本发明旨在提供一种鼻咽癌EB病毒特异性DNA酶检测试剂盒，通过检测血清中EBv-DNA酶的抗酶率从而实现对早期鼻咽癌患者的无创伤快速诊断，安全灵敏。本发明还提供该检测试剂盒的制备方法。

本发明鼻咽癌EB病毒特异性DNA酶检测试剂盒，包含标准DNA，标准SYBR GreenI，EB病毒特异性DNA酶，稀释缓冲液。

所述标准DNA的浓度为35μg/ml，体积为15ml；所述标准SYBR Green I的浓度为10×工作液，体积为80μl；所述EB病毒特异性DNA酶的浓度0.08～0.25U/ul，体积为100μl；所述稀释缓冲液为TE Buffer，其中Tris·HCl 0.01M，EDTA 0.001M，pH7.0，体积为20ml。

本发明还提供该鼻咽癌EB病毒特异性DNA酶检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

(1)标准DNA的生产和纯化：发酵培养含有p-CL质粒的大肠杆菌以生产标准DNA，所述标准DNA为p-CL质粒；提取所述的p-CL质粒；

(2)EB病毒特异性DNA酶的生产和纯化：在培养人Burkitt`s淋巴瘤细胞株的过程中，以巴豆油和正丁酸作为诱导剂，同时采用Epstein-Barr病毒重复感染Raji细胞，大量生产EB病毒特异性DNA酶；纯化所述的EB病毒特异性DNA酶；