[发明专利]栎枯萎病菌的巢式PCR检测方法无效
| 申请号： | 200910034195.0 | 申请日： | 2009-09-02 |
| 公开（公告）号： | CN101691605A | 公开（公告）日： | 2010-04-07 |
| 发明（设计）人： | 吴翠萍;陈贯源;粟寒;李彬;郑斯竹;安榆林;叶建仁 | 申请（专利权）人： | 江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 |
| 主分类号： | C12Q1/68 | 分类号： | C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/645 |
| 代理公司： | 南京众联专利代理有限公司 32206 | 代理人： | 王荷英 |
| 地址： | 210001*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 枯萎 病菌 pcr 检测 方法 | ||
1.一种栎枯萎病菌的巢式PCR检测方法，提取栎枯萎病菌样品的DNA，-20℃保存备用，其特征是，设计鉴别栎枯萎病菌的特异性引物CF01/CF02，其序列为：
上游引物CF01：5’-GGCAGGGACTTCTTTCTT-3’；
下游引物CF02：5’-AAGGCTTGAGTGGTGAAA-3’；
利用通用引物ITS1/ITS4和特异性引物CF01/CF02，进行栎枯萎病菌的Nested PCR扩增，所述通用引物ITS1/ITS4的序列为：
ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；
ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；
扩增步骤如下：
第一轮扩增：通用引物PCR扩增
反应体系总体积为25μl，反应组分为：10×的反应缓冲液2.5μl，25mM的MgCl22.5μl，2.5mM的dNTP 2.5μl，10μM的上下游引物ITS1/ITS4各1μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.25μl，模板栎枯萎病菌样品DNA提取液1μl，灭菌水补足25μl；扩增反应程序为：预扩增95℃180秒，接着94℃30秒，50℃30秒，72℃60秒，20个循环，最后在72℃延伸300秒；
第二轮扩增：特异引物PCR扩增
反应体系总体积为25μl，将第一轮PCR产物稀释10倍，取1μl作为模板，其它反应组分：10×的反应缓冲液2.5μl，25mM MgCl22.5μl，2.5mM dNTP 2.5μl，10μM的上下游引物CF01/CF02各1μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.2μl，灭菌水补足25μl；扩增反应程序为：预扩增95℃180秒，接着94℃30秒，60℃30秒，72℃60秒，35个循环，最后在72℃延伸300秒；
扩增产物进行电泳检测：
取8μl第二轮PCR扩增产物，采用1.5％(质量/体积)琼脂糖凝胶，在电压150V下电泳30分钟，之后置于EB内染色20分钟，取出，于凝胶成像系统下拍照检测，如果存在280bp的DNA特异性条带，则确定所检测的病菌为栎枯萎病菌。
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