[发明专利]栎枯萎病菌的巢式PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种主要通过原木、木质包装等携带传播的栎枯萎病菌的检测方法，特别是栎枯萎病菌的巢式PCR检测方法(或称Nested PCR法)，属于生物技术领域。

背景技术

栎枯萎病是由栎枯萎病菌(Ceratocystis fagacearum，缩写为C.fagacearum)所引起的主要危害栎属树种的一种真菌病害，目前分布于北美的美国，加拿大以及欧洲的保加利亚、波兰、罗马尼亚等国，国内尚未发现。

栎枯萎病(Ceratocystis fagacearum)，1942年首先在威斯康辛州洲发现，造成当地红栎的迅速死亡。此后该病害不断蔓延，目前美国中东部地区的20多个州都已有发现，已成为美国国内栎树类树种的主要毁灭性病害。在危害严重的威斯康星州和明尼苏达州每年有成千上万的栎树枯死。目前，它已被我国，欧盟(EU)和欧洲植保组织(EPPO)各成员国列为检疫性有害生物。

该病原菌短距离传播主要通过病健根的嫁接，还能通过媒介昆虫在地面进行传播，其中最主要的是露尾甲和小蠹虫。病菌的远距离传播则主要通过带菌的苗木及潮湿的栎树原木或其产品的长途运输来进行。近年来，我国从美国，加拿大等疫区进口苗木及木质包装的数量急剧上升，因此，在这些植物性材料中极有可能携带着病原菌，且我国的寄主分布与生态气候条件都很利于该病菌的定殖扩散，面对如此严峻的形势，需尽快建立一套快速、灵敏、可靠的检测方法，避免该病菌的侵入从而给我国森林资源和林业生产所造成的巨大损失。

迄今为止，世界上对于栎枯萎病菌的分子检测方法报道的较少，1999年，R.C.WITTHUHN等人建立了PCR-RFLP技术来区分长喙壳属一些重要种的系统发育关系，其中也包括了C.fagacearum，但是该方法成本高，过程复杂，检测灵敏度低，难以定量，且对于样品DNA的纯度要求比较高，故不适宜在各检疫口岸推广和应用。

近年来，越来越多的研究者采用分子生物学的方法来检测林木病原菌。利用细胞核内或线粒体内rDNA为检测位点的PCR技术在真菌鉴定的不同分类水平上都有着广泛的应用。其中核糖体基因上的一部分，转录间隔区(ITS1和ITS2)由于在种内比较保守， 但在种间存在多态性，此外，由于细胞核内或线粒体内rDNA是多拷贝，即使样本DNA量很少或质量并不高的情况下也可以扩增出应有的产物，所以目前很多分子检测方法的建立都是基于这一位点。而关于栎枯萎病菌的Nested PCR检测方法，甚至其它分子检测方法，国内外均未有报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种适宜于检疫口岸使用的栎枯萎病菌的巢式(Nested)PCR检测方法，以便于快速、灵敏、准确地对口岸苗木及木质包装进行栎枯萎病菌的检测。

本发明从病菌的菌丝、土壤或木块中提取病菌的DNA，以样品DNA作为模板，进行第一轮通用引物的PCR扩增，再以第一轮PCR产物为模板，进行第二轮特异性引物的PCR扩增，扩增产物进行电泳检测。

具体检测方法如下：

1.提取栎枯萎病菌样品的DNA，低温保存备用；

2.设计一对鉴别枯萎病菌的特异性引物

根据GeneBank公布Ceratocystis属的ITS区域序列的碱基组成差异(登录号：EU918711，AY528959，DQ318196，AY214001，U75626，U75627，EF042612，EF190968，AY233924，FJ347031，AY233921，DQ318195，EU245018，AY528999，DQ074743，DQ074742，DQ318203，AY821864，AF043607，U75630，DQ318198，EF042613，DQ318202，AY528973，AF275495，DQ318205，U75621，EF408554，AY529004，AY907044，AY907036，DQ061281)，利用引物设计软件(Primer Premier5)，设计一对能鉴别栎枯萎病菌的特异性引物CF01/CF02，其序列为：

上游引物CF01：5’-GGCAGGGACTTCTTTCTT-3’；

下游引物CF02：5’-AAGGCTTGAGTGGTGAAA-3’；