[发明专利]检测二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的酶联免疫试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于免疫学技术领域，具体涉及一种检测二乙氧基硫代磷 酸酯类有机磷农药的酶联免疫试剂盒及使用所述试剂盒检测农药残 留的方法。

背景技术

有机磷类农药由于高效，廉价而在农业和种植业上广泛使用，但 是有机磷农药，作为神经毒物，会引起神经功能紊乱、震颤、精神错 乱、语言失常等症状。在2002年中华人民共和国公布的第199号公 告上明令禁止在蔬菜、果树、茶叶、中草药材上不得使用和限制使用 的农药共有19种，其中有机磷农药占了17种，而含二乙氧基硫代磷 酸酯共有结构的农药就有8种。

目前国内外的农药残留免疫检测研究，基本上都集中于单组分特 异性检测及相应试剂盒的研制，但是实际生产中，食物中残留的农药 种类较多，单组分试剂盒很难实现快速高通量的检测，虽然仪器多残 留检测已经可以实现越来越多组分的多残留检测，但所需仪器复杂昂 贵，而且样品前处理繁琐费时，操作需专业人员、检测费用高，很难 适应许多场合快速检测的需要。因此，实现农药多残留快速检测，已 经是国内外残留分析的一种新趋势。

目前农药多残留免疫检测国内研究成果比较少，国外仅有少量用 多克隆抗体和单克隆抗体进行有机磷农药多残留免疫检测的理论研 究报道，未提供实际样品的检测方法和具有经济效益检测产品，现有 的单组分试剂盒很难实现高通量快速的检测，为了实现农药的高通 量、快速、灵敏检测要求，开发新的有机磷多残留检测试剂盒十分迫 切。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供二乙氧基硫代磷酸 酯类有机磷农药抗体，是一种多克隆抗体，具有广谱特异性，实际应 用性强。

本发明的另一个目的是提供所述抗体的制备方法。

本发明还有一个目的是提供所述抗体在有机磷农药多残留ELISA 检测方法中的应用。

本发明的技术方案是：

提供一种二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的酶联免疫分析试 剂盒，包括盒体、固体载体、特异性抗体溶液、二抗溶液、标准溶液、 浓缩提取液、底物液、底物缓冲液、浓缩洗涤液和终止液，所述酶标 板包被了二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药抗原；所述特异性抗体溶 液为抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的抗体溶液；所述二抗溶液 为辣根过氧化酶标二抗溶液；所述标准溶液为有机磷农药标准溶液。

本发明所指的一类有机磷农药共有结构是二乙氧基硫代磷酸酯。

本发明所述的一类有机磷农药指含有二乙氧基硫代磷酸酯共有 结构的有机磷农药，尤其是对硫磷、蝇毒磷、喹硫磷、三唑磷、辛硫 磷、除线磷、甲拌磷、毒死蜱、乙基溴硫磷、氯唑磷、二嗪磷、治螟 磷及它们的混合物。

所述固体载体是聚苯乙烯96孔或40孔酶标板。包被了二乙氧基 硫代磷酸酯类有机磷农药抗原的酶标板在制作过程中，所用的包被原 是将二乙氧基硫代磷酰氯与氨基己酸亲和取代后制得的半抗原，与卵 清蛋白(OVA)偶联制备得到的包被原。所用的包被液是pH9.6，0.05M 碳酸盐缓冲液，封闭液是3.0～5.0％脱脂奶粉。酶标板材质可以为聚乙 烯、聚苯乙烯、聚丙烯、纤维素、玻璃等。

所述二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药抗原是用二乙氧基硫代 磷酰氯与氨基己酸亲核取代合成半抗原，再采用活泼酯法将半抗原与 载体蛋白进行偶联制备得到。

所述抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药抗体是单克隆抗体。具 体指鼠单克隆抗体。制备过程中，免疫原是将二乙氧基硫代磷酰氯和 对羟基肉桂酸亲核取代后得到的半抗原与牛血清蛋白(BSA)采用活 泼酯法进行偶联得到的。所用的抗体稀释液是pH7.4，0.01～0.05mol/L 的磷酸盐缓冲液，所用抗体的浓度为0.06～0.24μg/mL。

所述抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药抗体的制备方法包括 以下步骤：

(1)二乙氧基硫代磷酰氯与对羟基肉桂酸反应合成免疫半抗原；

(2)半抗原偶联载体蛋白得到免疫原；

(3)免疫原免疫Balb/c小鼠制备脾细胞，通过细胞融合，筛选 分泌目标抗体的杂交瘤细胞，采用Balb/c小鼠体内诱生法制备腹水， 纯化腹水得到抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药单克隆抗体。