[发明专利]乙肝病毒L基因和hGM-CSF的融合基因及其表达载体的构建与应用

权利要求书

1、一种乙肝病毒全包膜L基因和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因的融合基因，其特征在于：其序列如SEQ ID NO.1所述。

2、一种包含了权利要求1所述乙肝病毒全包膜L基因和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因的融合基因的真核表达载体的构建和表达方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)引物设计：

根据乙肝病毒全包膜L基因的编码序列，设计扩增乙肝病毒全包膜L基因的1对引物：

上游引物序列为：P15′-CAGCTAGCATAATGGGAGGTTGGTCT-3′，含NheI酶切位点和起始密码子；

下游引物序列为：P25′-GGCGGAAGCTTAATGTATACCCAAAGAC-3′，含HindIII酶切位点，并删除终止密码子；

根据人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因的编码序列，设计扩增人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因的1对引物：

上游引物序列为：P35′-CCAAGCTTTCCGGTGGAGGTTCCATGTGGCTGCAGAGCC-3′，含HindIII酶切位点和含TCCGGTGGAGGTTCC的Linker序列；

下游引物序列为：P45′-CGGAATTCATTCACTCCTGGACTGGCTC-3′，含EcoR I酶切位点和终止密码子；

(2)L基因的克隆与重组pVL质粒的构建：

将乙肝表面抗原阳性患者血清采用苯酚/氯仿抽提法获得DNA提取液，作为L基因扩增模板，用步骤(1)设计的引物P1和P2进行常规链式聚合酶反应，扩增出乙肝病毒全包膜L基因片段，将纯化后的乙肝病毒全包膜L基因片段和质粒pVAX1分别用NheI和HindIII进行双酶切，纯化、连接、转化获得重组质粒pVL；

(3)重组质粒pVAX1-L-hGM的构建：

以质粒pORF-hGMCSF作为模板，用步骤(1)设计的引物P3和P4进行常规链式聚合酶反应，扩增获得人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因；将纯化的人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因与步骤(2)所得重组质粒pVL分别用HindIII和EcoRI双酶切，纯化、连接、转化获得重组质粒pVAX1-L-hGM；

(4)重组质粒pVAX1-L-hGM转染真核细胞及体外表达鉴定：

将酶切和测序鉴定正确的步骤(3)所得重组质粒pVAX1-L-hGM转染HEK293细胞，并通过免疫组织化学法和蛋白印迹法检测融合基因的表达蛋白质。

3、根据权利要求2所述真核表达载体的构建和表达方法，其特征在于：步骤(2)所述常规链式聚合酶反应具体步骤如下：将混合液在94℃预变性5min，然后进入下列循环：94℃、45s，55℃、45s，72℃、1min，共进行30个循环，最后72℃延伸10min，扩增完毕后置4℃终止反应；所述混合液组成如下：

浓度为10umol/l的上游引物P1                       1μl

浓度为10umol/l的下游引物P2                       1μl

dATP、dTTP、dCTP、dGTP的浓度

各为2.5mM的dNTP混合物                            4μl

DNA提取液                                        5μl

含Mg²⁺的Ex耐热性DNA聚合酶反应缓冲液              5μl

Ex耐热性DNA聚合酶                                0.25μl

灭菌水                                           33.75μl