[发明专利]乙肝病毒L基因和hGM-CSF的融合基因及其表达载体的构建与应用

说明书

技术领域

本发明属于医药生物工程技术领域，特别涉及一种乙型肝炎病毒全包膜蛋白L基因与人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子hGM-CSF基因的融合基因及其表达载体的构建与应用。

背景技术

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)的感染是一个非常严重的全球性健康问题。据世界卫生组织(WHO)公布的资料，目前全球60亿人口中有20亿人感染过乙型肝炎病毒，占全球人口三分之一。在乙肝病毒携带者中，约25％的人最终将转化为慢性肝病，包括肝硬化和肝癌。到目前为止，仍然没有特效药物消除人体内的乙肝病毒，一旦发病只能对症治疗。控制乙肝传播的主要手段是接种有效的疫苗进行预防和有效地阻断传播途径，从而降低其发病率。目前应用的乙肝基因工程疫苗主要由中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)和啤酒酵母表达的乙肝病毒表面抗原主蛋白(S蛋白)颗粒组成，在临床上表现出了较好的免疫效果。但是，在应用的过程中发现仍有10％～20％人群接种乙肝疫苗表现为无反应或弱反应，甚至根本不产生抗体，且仅有预防作用，而无治疗作用。随着年龄的上升，无反应或弱反应者增多，尤其是在艾滋病感染者、肾透析和免疫抑制病人中这种低反应或不反应的发生率会更高。另外，由于长期推广乙肝疫苗后，HBV S基因变异株以弱势准种形式广泛存在，有可能在免疫后人群中流行而成为新的公共问题。因此，目前使用的乙肝基因工程疫苗迫切需要得到改进。研制新型免疫原性更好的乙肝疫苗是国内学者迫切需要解决的课题。

DNA疫苗具有亚单位疫苗或灭活疫苗的安全性，同时具有减毒疫苗或重组疫苗才具有的诱导保护性细胞免疫应答的特点。目前，乙肝DNA疫苗应用面临的主要问题是目的基因表达效率较低，安全性问题没有很好解决，发酵纯化等下游工艺仍不成熟。然而，乙肝DNA疫苗的优势是显而易见的：其构建方便、制备工艺简单、化学性质稳定、保存运输方便、价格低廉、可用于构建多价疫苗及预防不同亚型的病毒感染。由于乙肝DNA疫苗可高效诱导包括体液免疫及细胞免疫的全身性免疫应答，因而不仅可以预防而且还可以治疗乙肝。

HBV基因组是一部分双链DNA分子，由约3200个碱基对组成，HBV基因组的全部顺序均为蛋白编码区，由相互重叠的4个基因S、C、P和X基因组成，分别编码外膜蛋白(HBsAg)、核心蛋白(HBcAg)、聚合酶和X蛋白。本发明中选择的乙肝抗原基因为可以表达乙肝包膜大蛋白(L蛋白)的S区全基因，即可表达PreS1、PreS2和S抗原三种抗原成分。许多实验结果表明：preS1肽段含有好几个免疫原性比S蛋白更强的T细胞和B细胞表位，由preS1引起的细胞特异性的细胞免疫应答可以帮助克服某些人对S蛋白的免疫无反应状态或同时对preS1和preS2蛋白双重无反应状态，preS2中也含有多个抗原表位和病毒中和位点。在疫苗制剂中加入preS1和preS2的抗原表位后，人群对传统的乙肝疫苗的不反应和低反应频率大大降低。Geissler等将包含preS1、preS2的S区基因以及HBcAg编码基因的重组质粒接种小鼠，诱导产生了高滴度抗-HBs及抗-HBc，93％的小鼠不仅产生了强烈的针对病毒蛋白的CD4+T细胞介导的体液免疫，而且产生了CD8+T细胞介导的CTL效应，同时伴有Th1细胞因子的产生。因而含有乙肝病毒preS2和preS1抗原成分或HBV S基因变异株核心蛋白成分的各种新型重组乙肝疫苗具有更大的免疫原性，能诱导更高效的免疫应答和抗体产生，中和乙肝病毒，保护机体免受病毒攻击，并可打破免疫耐受，清除乙肝病毒。