[发明专利]毕赤酵母工程菌株的构建方法和右旋糖酐酶的制备工艺

权利要求书

1.一种毕赤酵母工程菌株的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)设计寡核酐酸引物Primer1：GCGCGAATTCATGACATTAATCT和Primer2：ATCGCGGCCGCGTTTATGGACCATTG，引物中分别引入限制性内切酶EcoRI和NotI，以油脂酵母1390基因组DNA为模板，克隆得到右旋糖酐酶基因；

(2)利用分泌表达载体pPIC9K，将双酶切后的右旋糖酐酶基因插入pPIC9K的多克隆位点(EcoRI和NotI)，并通过连接、转化、酶切等分子生物学技术操作，构建出整合分泌型表达载体(pPIC9K-139)；

(3)用限制性内切酶Bgl II，对重组表达载体(pPIC9K-139)线性化，电击转化毕赤酵母GS115，采用α-factor，实现右旋糖酐酶的分泌表达，在含有G418的YEPD平板上进行筛选，得到重组毕赤酵母工程菌株(GS115-139)。

2.根据权利要求1所述的毕赤酵母工程菌株的构建方法，其特征在于：所述的毕赤酵母工程菌株(GS115-139)的右旋糖酐酶基因为多拷贝。

3.一种制备右旋糖酐酶的工艺，其特征包括如下工序为：

(1)培养基配方：基础培养基由10×Basal salt+250×PTM1+5％(w/v)葡萄糖+0.02％泡敌组成；

(2)接种：将如权利要求1或2所述的毕赤酵母工程菌株(GS115-139)接种到上述培养基中培养，培养条件为：温度25～35℃，PH5.0～7.0，溶氧量大于20％；

(3)诱导产右旋糖酐酶：接种培养24-48小时后，流加甲醇，甲醇浓度在0～1％范围；

(4)分离提纯右旋糖酐酶：采用离心、过滤的方法分离细胞，然后选择适当超滤膜截流、浓缩发酵液、进行低温喷雾干燥或载体吸附，得到右旋糖酐酶。