[发明专利]毕赤酵母工程菌株的构建方法和右旋糖酐酶的制备工艺

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域和蛋白质的分泌表达领域，特别是分泌表达右旋糖酐酶的毕赤酵母工程菌株的构建，以及右旋糖酐酶的制备工艺。

背景技术

在制糖工业中，由于受甘蔗品种、天气、土壤以及糖厂生产环境的影响，物料中都含有不同量的葡聚糖，造成直接的糖分损失高达1.0％左右；葡聚糖的存在使制糖工艺过程困难增加，主要体现在虚假旋光度的存在、糖液粘度增加、过滤困难、结晶不正常、能耗增加、品质降低等，因此而造成的糖分损失更是直接糖分损失的3-5倍，即传统制糖过程中因葡聚糖原因造成糖分损失4％左右。因此，如何减少葡聚糖以及控制其负面影响是我国糖业界一个迫切需要解决的问题。

我国90％以上的制糖企业采用亚硫酸法制糖工艺，此工艺为了消除葡聚糖等大分子物质的影响，采用的清净工艺通常加入石灰、二氧化硫、聚丙烯酰胺(絮凝剂)、表面活性剂，杀菌剂和脱色剂等数种物质当作提纯剂除去葡聚糖、淀粉等，但其清净效率不高、造成环境污染，清净前后的纯度差、并增加了外源的非糖物质，造成产出的白糖中葡聚糖的含量较高，这也就决定了后工序不可能结晶出高品质糖；直接影响其作为食品原料的加工性状，如造成饮料浑浊、影响巧克力等糖果的成形和包装等。随着人们对食糖及添加食糖的食品质量的要求越来越高，葡聚糖的负面影响显得越来越严重。因此，改进现有清净工艺，提高清净工艺的效率、减少葡聚糖造成的损失及其负面影响是我国制糖行业升级的关键技术瓶颈之一。

右旋糖酐酶是一种具有催化葡聚糖降解的活性蛋白质，可以在较温和的条件下，除去葡聚糖，将其转化成小分子的单糖或寡糖，降低粘度、加快沉降过滤速度、减少蒸煮时间、降低蒸汽消耗、提高糖的品质等，增加蔗糖的回收率。右旋糖酐酶在制糖中的作用效果非常显著，据制糖专家James报道，在制糖过程中加入右旋糖酐酶后，糖分回收提高3-5％，糖的质量也明显提高。右旋糖酐酶的应用能够显著的提升制糖产业的品质和竞争力。酶法清净工艺对于提高效率、降低能耗和减少排污有显著效果，是典型的绿色化学处理工艺。高效右旋糖酐酶及复合酶制剂的开发成功，能够实现节能降耗、提升品质、提升竞争力，可有效消除葡聚糖在制糖行业的负面影响，无疑对制糖行业清洁生产、技术进步及促进产业发展具有显著的积极意义。

目前右旋糖酐酶主要是从薄青霉(Penicillium lilacinum)和细丽毛壳属(Chaetomiumsp.)等菌株培养得到，亦有利用上述来源的基因进行工程菌构建的报道，但制备的右旋糖酐酶不能很好地适应制糖过程中的温度和pH，且制备成本高，因此尚未有大量应用于制糖工业中的右旋糖酐酶的报道。

发明内容

本发明的目的是：

(1)提出能分泌表达毕赤酵母工程菌株的构建方法；

(2)提出利用毕赤酵母工程菌株制备右旋糖酐酶的工艺，其具有培养基碳源普通廉价，工艺条件简单，制造成本低等优点。

本发明的技术方案如下：

一种毕赤酵母工程菌株的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

(1).设计寡核苷酸引物(Primer1：GCGCGAATTCATGACATTAATCT和Primer2：ATCGCGGCCGCGTTTATGGACCATTG)，引物中分别引入限制性内切酶EcoRI和NotI，以油脂酵母1390基因组DNA为模板；克隆得到右旋糖酐酶基因，并进行测序鉴定。

(2).利用分泌表达载体pPIC9K，将EcoRI和NotI双酶切后的右旋糖酐酶基因插入pPIC9K的多克隆位点(EcoRI和NotI)，并通过连接、转化、酶切等分子生物学技术操作，构建出整合分泌型表达载体(pPIC9K-139)。

(3).用限制性内切酶Bgl II，对重组表达载体(pPIC9K-139)线性化，电击转化毕赤酵母GS115，借助α-facor分泌信号肽，实现右旋糖酐酶的高效分泌表达，在含有G418的YEPD平板上进行筛选，测定右旋糖酐酶酶活，得到重组毕赤酵母工程菌株(GS115-139)，该毕赤酵母工程菌株(GS115-139)的右旋糖酐酶可为多拷贝。

一种利用上述毕赤酵母工程菌株(GS115-139)制备右旋糖酐酶的工艺，其特征包括如下工序：

(1)培养基配方：基础培养基由10×Basal salt+250×PTM1+5％(w/v)葡萄糖+0.02％泡敌组成；

(2)接种：将毕赤酵母工程菌株(GS115-139)接种到上述培养基中培养；