[发明专利]一种人染色体P16基因探针的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种人染色体P16基因探针的制备方法，还涉及利用人染色体P16基因探针制备一种人染色体P16基因检测试剂盒，应用本发明的人染色体P16基因探针及相应的试剂盒可以对人染色体P16基因异常进行准确、快速的检测。

背景技术

P16基因又叫MTS(multiple tumor suppressor 1)基因，定位于人染色体9p21，直接参与细胞周期的调控，负调节细胞增殖及分裂，在人类50％肿瘤细胞株中发现有纯合子缺失、突变，认为P16是比P53更重要的一种新型抗癌基因。P16基因已经在肺癌、乳腺癌、脑肿瘤、骨肿瘤、皮肤癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、淋巴瘤和黑色素瘤中发现纯合子缺失以及无义，错义及移码突变[Kaye FJ.RB and cyclin dependent kinase pathways：defining a distinction between RB and p16loss in lung cancer[J].Oncogene，2002，21(45)：6908-6914.][Bazan V，Zanna I，Migliavacca M，et al.Prognostic significance of p16INK4a alterations and 9p21loss of heterozygosity in locally advanced laryngeal squamous cell carcinoma [J].J Cell Physiol，2002，192(3)：286-293.][Yoshida S，Todoroki T，Ichikawa Y，et al.Mutations of p16Ink4/CDKN2 and p15Ink4B/MTS2genes in biliary tract cancers [J].Cancer Res，1995，55(13)：2756-2760.][Calero Moreno TM，Gustafsson G，Garwicz S，et al.Deletion of the Ink4-locus(the p16ink4a，p14ARF and p15ink4b genes)predicts relapse in children with ALL treated according to the Nordic protocols NOPHO 86 and NOPHO 92[J].Leukemia，2002，16(10)：2037 2045.]，表明P16基因以缺失，突变方式广泛参与肿瘤形成，检测P16基因有无改变对判断患者肿瘤的易感性以及预测肿瘤的预后，具有十分重要的临床意义。

目前常用的染色体组型分析可以进行染色体异常的分析，但这需要进行细胞培养和制备高质量的中期染色体片，而这对于肿瘤细胞来说是极其困难和耗时的。为了解决这个技术难题，其中一个思路是筛选并制备相应的区段分析基因探针，但目前染色体区段分析基因探针制备缺乏一个系统和成熟的方法。

本发明人在长期研究的基础上设计及筛选人染色体P16基因探针，并利用荧光原位杂交技术检测中期或间期细胞中的人染色体P16基因。它应用荧光物质标记的双链DNA核酸探针与染色体DNA互补序列杂交，在核中或染色体上显示DNA序列的位置。在此基础上本发明人还开发人染色体P16基因检测试剂盒，该试剂盒具有快速、无创性、敏感度高和特异性强等优点，无需进行细胞培养，就能够在中期和间期细胞中检测人染色体P16基因的异常。

由于本发明提供了这种人染色体P16基因探针的制备方法，并在此基础上自主研制开发人染色体P16基因检测试剂盒，对摆脱对进口试剂的依赖，填补国内该检测领域的空白具有十分重大的意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种人染色体P16基因探针的制备方法。

根据本发明一个优选的实施方案人染色体P16基因探针的制备步骤包括：

(1)克隆筛选：P16基因位于人染色体9p21区段，挑选包含有该基因的克隆。

(2)克隆培养和鉴定：购买克隆，取适量克隆菌液添加到500ml的TB培养液(氯霉素抗性)中，37℃摇床中摇菌培养24～48小时；使用STS引物对进行克隆鉴定。

(3)P16基因探针制备：对鉴定阳性的菌液，进行质粒DNA的提取；通过适当稀释质粒DNA，对质粒DNA定量；然后，通过缺口平移方法对质粒DNA进行荧光标记；对标记产物进行乙醇沉淀和浓缩；获得P16探针，避光、-20℃储存。

(4)P16基因探针验证：使用人类正常分裂中期淋巴细胞滴片进行探针验证。