[发明专利]一种里氏木霉表达盒及其重组菌株和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种里氏木霉表达盒及其重组菌株和应用。

背景技术

里氏木霉(Trichoderma reesei)是高效的纤维素酶产生菌，其纤维素酶系包括五种内切-β-葡萄糖苷酶(EG I、EG II、EGIII、EGIV和EGV)、两种纤维二糖水解酶(CBH I和CBHII)和两种纤维二糖酶(BG I和BGII)，其中CBH I的含量最高，其表达量可达里氏木霉胞外分泌性蛋白总量的50％，而在诱导的情况下里氏木霉合成和分泌蛋白的总量最高可达到40g/L。

里氏木霉的CBH I由单拷贝的cbh1基因编码，由此可见，调控其表达的cbh1启动子是一个很强的丝状真菌启动子，因此，利用cbh1基因启动子构建的里氏木霉表达系统被认为是一种有效的表达系统。

目前，国内外所构建的里氏木霉表达系统均使用cbh1启动子调节外源基因的表达。芬兰的VTT生物技术实验室于1990年代率先构建了基于cbh1启动子的里氏木霉表达系统，并进行了异源和同源蛋白的一系列表达(Haakana H，Miettinen-oinonen A，Joutsjoki V.Enzyme Microb Technol.2004，34(2)：159-167)。Mantyla等将真菌Chaetomium thermophilum中编码三个木聚糖酶的基因置于cbh1强启动子的控制之下，用此表达盒转化里氏木霉后获得了高效表达木聚糖酶的工程菌种。替换染色体的cbh1位点之后，EG1的产量是通常强纤维素分解菌所产CBH I量的2倍或者与其一样多(Mantyla A，PaloheimoM，Haskola S.Appl Microbiol Biotechnol.2007，76(2)：377-386)。Miettinen-Oinonen等用eg2置换cbh1，使其位于cbh1启动子的下游表达(Miettinen-Oinonen A，Suominen PL.Appl Environ Microbiol 2002，68(8)：3956-3964)，结果发现，内切葡萄糖苷酶的活力比出发菌株增加2.3倍；再增加一个转化到里氏木霉中的eg2表达盒的拷贝数，内切葡萄糖苷酶的活力比出发菌株增加3倍。汪天虹等构建了P_cbh1-eg3-T_cbh1表达盒，用eg3基因替换了cbh1基因，成功地实现了EG 3在cbh1启动子控制下的表达(Wang TH，Liu T，Wu ZH.ACTA Biochim Biophysica Sin.2004，36(10)：667-672)。

里氏木霉被广泛用来表达同源蛋白和异源蛋白(如来源于动物的基因)，而且里氏木霉在大规模生产条件中(高达360m³发酵液)的表现良好，特别适于蛋白的大量生产。然而，在里氏木霉中使用cbh1基因启动子表达蛋白时必须使用纤维素、乳糖或槐二糖等进行诱导，而诱导不仅使cbh1基因启动子被激活，而且会使其它纤维素酶组分的启动子被激活。这将使表达液中杂蛋白的含量高，一方面造成原料的浪费，另一方面不利于对表达产物进行分离纯化。

使用强的组成型启动子，利用里氏木霉高效的合成和分泌能力进行蛋白的表达可能是解决这一问题的有效手段。组成型启动子在以葡萄糖为碳源的培养基中不受阻遏，不需要诱导就可以启动目的基因的转录。对于里氏木霉而言，使用组成型启动子将可以避免产生过多的杂蛋白，因为里氏木霉所产生的胞外蛋白多是经诱导后产生的纤维素酶组分。

Joutsjoki VV等人就将酿酒酵母DPM1基因(编码甘露糖基磷酸多萜醇合成酶)的编码区插入到pLMRS3质粒中，在瑞氏木霉pki启动子和cbh2终止子控制下表达。在pFG1质粒(含有瑞氏木霉pyr4基因)存在下，与pLMRS3质粒一起对瑞氏木霉的一种pyr4阴性突变株TU-6进行共转化，然后筛选pyr4阳性转化子，得到4株多拷贝DPM1基因串联整合的稳定转化子。与受体菌株TU-6相比，转化子的甘露糖基磷酸多萜醇合成酶活力提高了15-19倍，分泌的蛋白总量也提高了4倍(Joutsjoki VV，Kuittinen M，Torkkeli TK，Suominen PL.FEMS Microbiol Lett.1993，112(3)：281-286)。