[发明专利]肺炎支原体快速检测试剂盒及使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用环介导恒温扩增(LAMP)技术进行菌样的快速检测的 方法，具体是一种肺炎支原体快速检测试剂盒(LAMP)及使用方法。

背景技术

肺炎支原体(MP)是人类支原体肺炎的病原体，是引起儿童呼吸道感染及 非典型肺炎的主要病原体之一。1/3以上的非细菌性肺炎都是由MP引起的， MP同时是社区获得性肺炎的重要病原体，人群密集的地方感染率高达50％。 快速、准确的检测肺炎支原体是有效防止肺炎支原体感染的前提条件。目前 临床上肺炎支原体的鉴定通常还是利用传统的生理生化方法进行鉴定，但由 于肺炎支原体对培养要求高及培养时间长(通常需要3~4天)，需要消耗大量 的人力和物力，现在已经越来越无法满足临床诊断发展的要求。

随着分子生物学的发展，临床诊断技术中已从传统的生化鉴定向分子生物 学方法如PCR、探针杂交等技术发展。PCR检测方法灵敏度高、特异性强，但 PCR法需昂贵的设备，操作复杂且对实验室的环境要求较高，检测费用亦较 高，致临床无法普及。

环介导恒温扩增技术(简称LAMP)是2000年开发出的一种新的核酸扩增 技术，它利用Bst大片段DNA聚合酶和根据不同靶序列设计的两对特殊的内 引物(FIP和BIP)、外引物(F3和B3)，特异地识别靶序列上的6个独立区 域。LAMP在恒温(65℃)的条件下反应1小时即可完成核酸扩增反应，通过荧 光染色直接目测比色就可以得到清晰的反应结果。不需要长时间的温度循环， 不需要PCR等昂贵的仪器，不需要繁琐的电泳紫外观察等过程。LAMP具有简 单、快速、特异性强的特点，能代替PCR方法的最新技术。现已被广泛应用 于微生物检测及胚胎性别鉴定等领域。如何运用环介导恒温扩增技术检测临 床肺炎支原体在临床诊断技术发展中具有重大意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种肺炎支原体快速检测试剂盒(LAMP)的制备和 使用方法，以提高肺炎支原体的诊断效率，节约时间，解决传统检测方法无 法满足临床诊断的发展要求，本发明通过无数次的试验检测，终于探索出一 种运用环介导恒温扩增技术检测临床肺炎支原体的方法，该方法具有检测快 速、便捷、低成本等特点。

本发明的主要原理是：利用Bst大片段DNA聚合酶和根据不同靶序列设计 的两对特殊的内引物(FIP和BIP)、外引物(F3和B3)，特异地识别靶序列 上的6个独立区域。其扩增原理是：FIP引物杂交在目标DNA的F2C区段， 启动互补链合成，导致DNA哑铃状结构的产生。此哑铃状结构很快以自身为 模板，进行DNA合成延伸，形成茎-环DNA结构，该茎-环结构是LAMP法基因 扩增循环的起始结构。LAMP反应以此DNA结构为起始结构，进行再循环和延 伸，靶DNA序列大量交替重复产生，形成的扩增产物是有许多环的花椰菜形 状的茎-环结构的DNA，数量级可达10⁹。LAMP在恒温(65℃)的条件下反应1 小时即可完成核酸扩增反应，通过荧光染色直接目测比色就可以得到清晰的 反应结果。

本发明涉及的肺炎支原体快速检测试剂盒(LAMP)，其中的试剂包括如下：

(1)环介导恒温反应管：

包括10×ThermoPol反应缓冲液、5-10pmol的引物1、5-10pmol的引物 2、20-40pmol的引物3、20-40pmol的引物4、1.4-1.6mmol/L的dNTP、 4-6mmol/L的硫酸镁、0.8-1.2mol/L的甜菜碱、0.4-0.5mmol/L的氯化锰和 25-50μmol/L的钙黄绿素；

其中，10×ThermoPol反应缓冲液含有200mM pH8.8的三羟基甲基氨基 甲烷-盐酸、100mM的氯化钾、100mM的硫酸铵、20mM的硫酸镁和1％的曲拉通 X-100；

其中所述dNTP中含有的dATP、dTTP、dCTP、dGTP的质量比为1∶1∶1∶1

其中所述引物1为：5-accctcgggggcagtcag-3；

所述引物2为：5-ctgattgtccctgctggtcc-3；

所述引物3为：5-gttcagagctggaggttggctttttcgatgattacaggcggttc-3；

所述引物4为：5-gggcggggtgaaggaatgatattttctcgtgaacttggtgtggt-3；

(2)Bst DNA聚合酶：8U/μL。