[发明专利]一种日本血吸虫性别特异性检测引物、检测试剂盒和检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及日本血吸虫的性别鉴别技术。

背景技术

日本血吸虫病是由日本血吸虫寄生于人和牛、羊、猪、马、犬、 猫、兔、啮齿类及多种哺乳动物的门静脉系统的小血管内引起的一种 危害严重的人兽共患寄生性吸虫病。该病以急性或慢性肠炎、肝硬化、 严重的腹泻、贫血、消瘦为特征，严重影响人类的健康和畜牧业经济 的发展。主要分布在中国、日本、菲律宾及印度尼西亚等西太平洋地 区的一些国家。其中，日本已于1997年正式向WHO申请，宣布其成 为血吸虫病非流行区。在我国，流行区位于长江流域及以南的地区， 除了已经实现血吸虫病传播阻断的上海、浙江、福建、广西和广东省， 目前该病仍在江苏、安徽、江西、湖北、湖南、云南和四川7个省份 流行，有约5000万人受到威胁，约80万人和超过10万头牛受到感染， 且传播还在持续。目前，它与结核病、爱滋病被列为我国最重要的三 大人类传染病。因此，对日本血吸虫病的准确诊断和有效防治成为亟 待解决的问题。

目前，对日本血吸虫病的诊断主要依靠粪检病原和免疫学方法进 行，但粪检检出率较低，容易漏诊，而各实验室建立的免疫学方法均 是根据当地实际情况进行的，对其广泛推广性及可比性还需要进一步 的研究；对于血吸虫病的防治主要依靠药物防治和疫苗预防，但药物 研制的抗药性和疫苗研制的长期性和复杂性成为该病防治的瓶颈。目 前研究发现，通过抑制或阻止日本血吸虫雌、雄虫合抱或抑制雌虫发 育不失为一种有效防治该病的新途径，但目前尚不明确日本血吸虫在 哪个阶段雌、雄虫发生分化。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术存在的不足，提供一对能用于检测 日本血吸虫性别的特异性检测引物。

本发明的另一个目的是提供利用上述引物制成的试剂盒。

本发明的进一步目的是提供利用上述试剂盒进行日本血吸虫的 性别检测方法。

本发明的技术方案是：

本研究室通过对来自于不同流行区的日本血吸虫分离株进行遗 传变异分析，发现了一段雌虫特异的DNA片段，通过测序发现不同 地区的雌虫几乎没有变异。本申请人根据此段雌虫特异序列设计种特 异引物如下：

Tsexu₂：5′-ACGTTAGATACTGCTGTTCA-3′

Tsexd₂：5′-ATATTGTTCCAAGTACGCAT-3′

本发明根据上述引物提供的用于鉴别日本血吸虫性别的试剂盒， 含有：

(1)DNA裂解液：Nucleilysis solution、EDTA、蛋白酶K和 RNase A solution的混合溶液；

(2)PCR反应液：dATP、dTTP、dGTP、dCTP、引物Tsexu₂、 引物Tsexd₂和MgCl₂的混合溶液；

(3)日本血吸虫雌虫DNA阳性对照和雄虫DNA阴性对照。 在上述试剂盒中，还可以添加Taq DNA聚合酶。

在上述试剂盒中，各物质的优选量为：

(1)DNA裂解液，27.5mL：为100个反应的200μl Nuclei lysis solution、50μl pH8.0的0.5M的EDTA、20μl蛋白酶K(20mg/mL) 和5μl RNase A solution(4mg/mL)的混合溶液；

(2)PCR反应液，2.5mL：为终浓度200μM的dATP、dTTP、 dGTP、dCTP，终浓度0.4pmol/μl的引物Tsexu₂和Tsexd₂，2mM的 MgCl₂的混合溶液；

(3)日本血吸虫雌虫DNA阳性对照DNA 100μl和雄虫DNA阴 性对照DNA100μl；

(4)阴性对照品：日本血吸虫雄虫阴性；

(5)Taq DNA聚合酶，5U/μl，25μl。

本发明同时提供所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：