[发明专利]人Bcl-2和人VEGF165双基因共表达重组载体及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及了一种双基因共表达重组载体及其构建方法，特别是涉及一种人Bcl-2和人VEGF₁₆₅双基因共表达重组载体及其构建方法。属于生物基因治疗领域。 

背景技术

心肌梗死(Myocardium infarction，MI)是在冠状动脉病变基础上发生冠状动脉血供急剧减少或中断，造成相应的心肌严重而持久地缺血导致心肌坏死。心肌细胞是终末分化细胞，心肌损伤后不能通过细胞再生而修复，而是形成纤维化瘢痕。目前临床上对MI的治疗方法主要是药物治疗、冠状动脉介入治疗和冠状动脉旁路手术，这三大方法虽然能使部分病人闭塞的血管再通并恢复血流灌注，一定程度上挽救濒死的心肌，减缓心肌重构和心衰进程，减轻患者症状，降低病死率。但由于这些疗法无法使梗死的心肌再生，使得远期预后仍不理想。心脏移植则由于存在供体缺乏、免疫排斥和费用昂贵等缺陷使其在临床上难以推广。因此，临床上需要一种新的治疗该疾病的有效手段。 

基因治疗或对干细胞基因修饰后移植治疗是当今研究心肌梗死治疗方法的热点，已进入临床研究的是抗凋亡基因或促血管生成基因等单基因的治疗方法。中国发明专利CN200810302770.6中涉及一种重组双基因腺病毒载体，其特点是在一个载体上重组了两种不同的基因，虽然其在疗效方面效果要比用单基因治疗效果好，但是这两种基因分别是bFGF蛋白的基因和PDGF-B蛋白的基因，同属于促进血管生成的因子，其效果只能是在促进血管生成上增加，而且此专利是采用两个启动因子，容易产生两个启动子间相互抑制导致一条基因表达抑制另一条基因表达的弊端。 

研究中发现，Bcl-2基因家族是目前已知的最重要的调控细胞凋亡的基因家族。Bcl-2基因及其编码的蛋白质能在不影响细胞周期和分化的情况下抑制细胞凋亡、延长细胞寿命。血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前发现的促血管生成作用最强的细胞因子。有研究表明，单独应用Bcl-2基因或VEGF基因对心肌梗死有明显的治疗效果，但仍不理想，有进一步提升的空间。在多数细胞中Bcl-2基因和VEGF基因之间存在着互相上调的级联关系，在生物学功能上能够形成协同作用。 

发明内容

本发明的目的之一，是为了构建一种人Bcl-2和人VEGF₁₆₅双基因共表达重组载体，为联合基因治疗心肌梗死的研究奠定基础。 

本发明的目的之二，是为了提供一种上述重组载体的构建方法。 

本发明的目的之一，主要通过以下技术方案实现： 

人Bcl-2和人VEGF₁₆₅双基因共表达重组载体，其特征是：所述重组载体包括人Bcl-2基因(hBcl-2)和人VEGF₁₆₅基因(hVEGF₁₆₅)； 

其中，hBcl-2基因序列如序列表SEQ ID№：1所述；hVEGF₁₆₅基因序列如序列表SEQ ID№：2所述；利用IRES片段连接hBcl-2、hVEGF₁₆₅基因，以AdEasy系统为基础利用细菌内同源重组机制重组构建本发明hBcl-2和hVEGF₁₆₅双基因共表达重组载体。 

本发明所用载体是腺病毒载体，腺病毒载体宿主范围广、转染效率和基因表达水平高、安全性较好，是基因治疗的优良载体，是心肌梗死基因治疗较为理想的载体。也可以使用其他腺相关病毒、慢病毒和质粒等其他载体。 

本发明的目的之二，主要通过以下技术方案实现： 

人Bcl-2和人VEGF₁₆₅双基因共表达重组载体的构建方法，其特征是：主要包括以下几个步骤： 

1)获得hBcl-2、hVEGF₁₆₅基因；(2)构建重组腺病毒穿梭载体pAd-Track-CMV-hBcl-2-IRES-hVEGF₁₆₅；(3)重组构建携带hBcl-2基因、IRES片段和hVEGF₁₆₅的腺病毒载体质粒pAd-Easy-CMV-hBcl-2-IRES-hVEGF₁₆₅；(4)脂质体转染法介导重组腺病毒载体质粒在HEK293细胞中的包装。 

本发明的目的之二，还可以通过以下技术方案实现：