[发明专利]乙型肝炎病毒YMDD基序突变检测特异性引物、液相芯片及方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及与乙型肝炎核苷类似 物治疗耐药性相关的病毒YMDD基序突变检测特异性引物、液相芯片及其检测方法。

技术背景

乙型肝炎是全球广泛分布的传染病，在许多国家呈现地域性分布。全世界有超过20亿的 人群感染过乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)，其中3.5～4亿是慢性携带者，而在中国 就有1.2亿人。慢性乙型肝炎可引起肝硬化、肝功能衰竭，肝癌等严重的肝脏疾病，全世界 每年约有100万的人因此而死亡。而中国是慢性乙型肝炎的重灾区，超过8％的人口为慢性携 带者，每年因肝病死亡的约有30万人左右。

慢性乙型肝炎治疗近年来得到很大改善，抗病毒药物的种类主要包括两大类，一类是核 苷类似物，一类是干扰素。干扰素主要是α干扰素和Pegylated干扰素，前者是乙肝治疗较早使 用的药物，后者于2005年许可上市。干扰素的特点是既可以直接抑制病毒，又具有免疫调节 作用，能够在抑制乙肝病毒复制的同时使病人达到免疫应答。但干扰素药物需注射使用，抑 制病毒的时间比核苷类似物要长，且费用相对较高，不良反应也比较大，因此部分患者不能 耐受干扰素。

现在已上市的核苷类似物药物有5种，分别是拉米夫定(Lamivudine，1998年上市)、阿 德福韦(Adefovir，2002年上市)、恩替卡韦(Entecavir，2005年上市)、汰比夫定(Telbivudine， 2006年上市)和泰诺福韦(Tenofovir，2008年上市)。这类药物通过干扰病毒的逆转录过程和 抑制DNA合成来抑制病毒DNA的复制，其特点是直接抑制病毒，因此能使患者的病毒DNA水 平快速下降，一、两个月就有明显的效果，但是核苷类似物不具备有免疫调节的作用。此外， 此类药物只需口服用药，不良反应较小，费用较低。

核苷类似物药物只能抑制病毒复制，而不能根除病毒，因此需要长期使用。而长期用药 则可能引发较高的比例的耐药。临床研究数据显示，拉米夫定治疗1～4年的基因耐药率分别 为14％、38％、49％、66％。研究已经证明核苷类似物药物耐药与病毒P基因的YMDD(酪氨 酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸)基序变异有直接关系。

目前报道的YMDD变异主要有rtL80I/V、rtV173L、rtL180M、rtA181V/T、rtM204V/I/S和 rtN236T。其中rtL80I/V、rtV173L、rtL180M、rtA181V/T和rtM204V/I/S与拉米夫定的耐药有 关，而rtA181V/T和rtN236T与阿德福韦的耐药有关，其它核苷酸类似物药物由于上市时间较 短，暂未发现显著的耐药现象。

YMDD变异导致拉米夫定耐药后，会使病人血清的谷丙转氨酶水平和病毒DNA水平升 高，甚至病情恶化。因此建立简单、快速的检测YMDD变异情况的方法可以及时、尽早发现 变异，从而调整用药和治疗方案，这对于控制疾病的进程和促进临床治疗是非常有意义的。

目前常用于检测乙肝病毒YMDD变异的技术主要有直接测序法、基于PCR的限制性片段 长度多态性分析(RFLP)技术、固相基因芯片技术等。直接测序法虽然一直被认为是检测基 因突变的金标准，但费时费力，不符合临床检测的高通量要求，灵敏度也不高。RFLP同样操 作步骤比较复杂，且检测结果受很多方面的影响，因此也不能满足临床大规模、快速、准确 检测的需求。固相基因芯片虽然能实现高通量检测，但价格昂贵，敏感性不高，检测结果可 重复性差。上面这些技术检测混合感染中的劣势型突变病毒株的能力较弱，因此在临床上均 不能做到及时、尽早地发现乙肝病毒的YMDD变异株。