[发明专利]一种分离基因重组蛋白的亲和-膜过滤载体的制法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种蛋白质分离材料的制备方法和应用，具体涉及一种分离基因重组蛋白 的亲和-膜过滤载体的制法与应用。

背景技术

基因重组蛋白的应用越来越广泛，重组蛋白的分离在一定程度上限制了其在我国各个 领域应用的深度和广度。亲和-膜过滤分离新技术根据目标蛋白的生物化学特性，将亲和配 基偶联到水溶性大分子基质上，在溶液状态下亲和载体特异性吸附目标蛋白形成分子团簇， 其微粒尺寸远大于其它杂质成分，在膜分离过程中可以实现分子团簇与杂质的高效分离， 因此，亲和-膜过滤分离兼具生物亲和的特异性和膜分离的快速、易放大。Mattiasson最初 提出了亲和-膜过滤法分离蛋白质的可行性，并成功地利用热致死细菌saccharommyces cerevisiae细胞膜上残基作为亲和配基，分离纯化了刀豆蛋白。此后，有关亲和-膜过滤分离 蛋白质的研究包括用m-氨基苯甲脒偶联高分子聚合物实现分子量接近的胰岛素和糜蛋白 酶的分离；用N-丙烯酰-m-氨基苯甲脒与丙烯酰胺的聚合物分离尿激酶；用生物素化脂质 体纯化抗生素蛋白avidin；用偶联染料Cibacron Blue的琼脂糖实现人血清白蛋白与溶菌酶 的相互分离；用高取代染料sephraose回收牛血清白蛋白等。由于胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶 的分子量相近，单独运用超滤的方法很难将二者完全分离开来，中国专利ZL 200410027191.7应用所合成的可溶性亲和载体，在超滤膜分离体系中通过吸附目标分子、 清洗杂蛋白、洗脱目标分子获得纯化的胰蛋白酶。结果表明，用配基为PAB的亲和载体纯 化胰蛋白酶，获得胰蛋白酶纯化倍数达到93倍，回收80％以上。

虽然从提出亲和-膜过滤分离技术至今已有20多年，但是，至今未见产业化应用。究 其原因，其一，亲和配基仅仅针对某一个或几个特定的蛋白质，难以形成规模化的分离纯 化方法；其二，这些亲和配基与目标蛋白间的作用力弱，需要多级膜分离才能达到理想的 分离效率；其三，在专利“水溶性亲和超滤载体的制备方法”(专利号ZL200410027191.7) 中载体的环氧反应效率低，载体环氧取代度仅0.3mmol/g左右，降低了载体材料的分离效 率。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足之处，提供一种分离基因重组蛋白的亲 和-膜过滤载体的制法与应用。本发明选择水溶性基质材料，偶联与基因重组蛋白中组氨 酸标记有强亲和作用的亲和配基和金属离子，制备出亲和-膜过滤分离载体材料，并应用 于基因重组蛋白的膜分离纯化，蛋白回收率高。

本发明目的通过以下技术方案来实现：

一种分离基因重组蛋白的亲和-膜过滤载体的制法，包括以下步骤：

(1)水溶性载体基质的碱活化：将水溶性载体基质溶解于碱溶液中，形成混合溶液， 其中，水溶性载体基质的重量百分数的2～6％，反应后得到碱活化载体；

(2)碱活化载体的环氧活化：向碱活化载体中加入环氧氯丙烷，组成反应体系，将反 应体系在超声场中反应2～5h，反应温度为30℃～50℃，得环氧活化载体；

(3)环氧活化载体与亲和配基的偶联：将亲和配体与环氧活化载体溶液以体积比1∶1～ 3∶1进行反应，反应温度为30℃～50℃，反应时间为2～5h，得偶联亚氨基二乙酸的载体；

(4)偶联亲和配基的载体与金属离子的耦合：将金属离子溶液与偶联亚氨基二乙酸的 载体溶液以体积比1∶1～3∶1进行反应，反应温度为20℃～40℃，反应时间为2～4h，得到 本发明的亲和-膜过滤载体。

步骤(1)所述的水溶性载体基质是葡聚糖，其分子量为1500000～3000000。

步骤(1)所述的碱溶液包括NaOH或KOH的水溶液，浓度为0.1～0.3mol/L；所述的 反应的温度为20～30℃；反应时间为20～40min。

步骤(2)所述的环氧氯丙烷占反应体系的体积百分数为2～6％，超声频率为35～ 130kHz，超声功率为200W～600W。

步骤(3)所述的亲和配体包括亚氨基二乙酸、次氮基三乙酸或N，N，N-三羧甲基乙 二胺。

步骤(3)所述的亲和配体的浓度为0.1～0.5mol/L，环氧活化载体溶液中载体的重量百 分数为2～4％。