[发明专利]一种稳定性同位素15N标记八肽GFL的制备方法

权利要求书

1.一种稳定性同位素¹⁵N标记八肽拟生长因子的制备方法，其特征在于，该 方法采用Fmoc固相肽合成法，以Wang-树脂为载体，以Fmoc保护的氨基酸为原 料，该原料中至少有一个氨基酸为稳定性同位素¹⁵N标记的，以HBTU、HOBt和 DIEA为缩合试剂，逐一接入氨基酸，氨基酸接完后经剪切、纯化制得稳定性同位 素¹⁵N标记八肽拟生长因子；

所述的方法具体包括以下步骤：

(1)Fmoc-Ile-Wang树脂的制备

1)将1.5mmol/g取代量的Wang-树脂放入干燥的多肽合成管中；

2)用二氯甲烷溶胀10～60min，用水泵抽干溶剂二氯甲烷，换用DMF洗涤5 次，每次用量2～5ml；

3)取2～10eq HBTU，加2～10eq Fmoc-Ile-OH，少量DMF溶解，加5～15eq DIEA， 混匀；

4)将上述溶液加入树脂中，反应1-2小时；

5)DMF 5ml×5min洗涤；

6)用2～10eq苯甲酸酐或醋酸酐加1eq吡啶封闭树脂上未反应的羟基，DMF 作反应溶剂，反应1小时；

7)用DMF、DCM、甲醇或正己烷5ml×5min洗涤，真空干燥，得到Fmoc-Ile-Wang 树脂；

(2)稳定性同位素¹⁵N标记八肽拟生长因子的制备

采用固相多肽合成的方法，从Fmoc-Ile-Wang树脂出发，用多肽合成管制备， 具体如下：

1)将0.1mmolFmoc-Ile-Wang树脂放入干燥的反应器中；

2)用二氯甲烷溶胀10～60min，DMF洗涤5ml×5min；

3)30％哌啶-DMF溶液脱Fmoc，5min×2次，溶液体积为溶胀后树脂体积的 2-3倍；

4)DMF洗涤5ml×5min；

5)取2～5eq HBTU，2～5eq HOBt，2～5eq Fmoc-Arg(Pbf)-OH，少量DMF 溶解，加4～10eq DIEA，混匀；

6)将上述溶液加入树脂中，反应1～2小时；

7)合成完毕，DMF洗涤5ml×5min，30％哌啶-DMF溶液脱Fmoc，5min×2次， 溶液体积为溶胀后树脂体积的2-3倍；

8)用DMF、DCM、甲醇或正己烷洗涤5ml×5min

9)取2～5eq HBTU，2～5eq HOBt，2～5eq Fmoc-Arg(Pbf)-OH，少量DMF 溶解，加4～10eq DIEA，混匀；

10)将上述溶液加入树脂中，反应1～2小时；

11)合成完毕，DMF洗涤5ml×5min；

12)30％哌啶-DMF溶液脱Fmoc，5min×2次，溶液体积为溶胀后树脂体积的 2-3倍；

13)用DMF、DCM、甲醇或正己烷洗涤5ml×5min；

14)取2～5eq HBTU，2～5eq HOBt，2～5eq Fmoc-Leu-OH，少量DMF溶解， 加4～10eq DIEA，混匀；

15)将上述溶液加入树脂中，反应1～2小时；

16)合成完毕，DMF洗涤5ml×5min；

17)30％哌啶-DMF溶液脱Fmoc，5min×2次，溶液体积为溶胀后树脂体积的 2-3倍；

18)用DMF或DCM或甲醇或正己烷洗涤5ml×5min；

19)取2～5eq HBTU，2～5eq HOBt，2～5eq Fmoc-Phe-OH，少量DMF溶解， 加4～10eqDIEA，混匀；

20)将上述溶液加入树脂中，反应1～2小时；

21)合成完毕，DMF洗涤5ml×5min；

22)30％哌啶-DMF溶液脱Fmoc，5min×2次，溶液体积为溶胀后树脂体积的 2-3倍；

23)用DMF、DCM、甲醇或正己烷洗涤5ml×5min；

24)取2～5eq HBTU，2～5eq HOBt，2～5eq Fmoc-Gly-OH，少量DMF溶解， 加4～10eq DIEA，混匀；

25)将上述溶液加入树脂中，反应1～2小时；

26)合成完毕，DMF洗涤5ml×5min；

27)30％哌啶-DMF溶液脱Fmoc，5min×2次，溶液体积为溶胀后树脂体积的 2-3倍；

28)用DMF、DCM、甲醇或正己烷洗涤5ml×5min；

29)取2～5eq HBTU，2～5eq HOBt，2～5eq Fmoc-Gly-OH，少量DMF溶解， 加4～10eqDIEA，混匀；

30)将上述溶液加入树脂中，反应1～2小时；

31)合成完毕，DMF洗涤5ml×5min；

32)30％哌啶-DMF溶液脱Fmoc，5min×2次，溶液体积为溶胀后树脂体积的 2-3倍；

33)用DMF、DCM、甲醇或正己烷洗涤5ml×5min；

34)取2～5eqHBTU，2～5eq HOBt，2～5eq Fmoc-Tyr(tbu)-OH，少量DMF 溶解，加4～10eqDIEA，混匀；

35)将上述溶液加入树脂中，反应1～2小时；

36)合成完毕，DMF洗涤5ml×5min；

37)30％哌啶-DMF溶液脱Fmoc，5min×2次，溶液体积为溶胀后树脂体积的 2-3倍；

38)用DMF、DCM、甲醇或正己烷洗涤5ml×5min；

39)用甲醇收缩树脂，加入少许甲醇，反应5min，重复2～5次；

40)用正己烷洗涤2～5次后，真空干燥；

41)剪切、纯化：将干燥后的树脂置于离心管中，加入剪切液静置反应1～5 时，反应完过滤，向滤液中加入5～10倍滤液体积的冷乙醚，沉淀产生，离心， 收集沉淀，烘干得到稳定性同位素¹⁵N标记八肽拟生长因子；

上述步骤(1)3)的Fmoc-Ile-OH、步骤(2)5)的Fmoc-Arg(Pbf)-OH、 步骤(2)9)的Fmoc-Arg(Pbf)-OH、步骤(2)14)的Fmoc-Leu-OH、步骤(2) 19)的Fmoc-Phe-OH、步骤(2)24)的Fmoc-Gly-OH、步骤(2)29)的Fmoc-Gly-OH、 步骤(2)34)的Fmoc-Tyr(tbu)-OH中至少有一个为稳定性同位素¹⁵N标记的氨 基酸。