[发明专利]一种稳定性同位素15N标记八肽GFL的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及稳定性同位素标记化合物，尤其涉及一种稳定性同位素¹⁵N标记八 肽拟生长因子的制备方法。

背景技术

随着后基因组计划的到来，蛋白质组研究成为生命科学的最前沿。在用核磁共 振(NMR)研究蛋白质结构以及定量蛋白质组学方面，稳定同位素(²H、¹³C、¹⁵N) 标记的多肽和蛋白质都大有用武之地，此类化合物已成为蛋白质组学领域不可或缺 的重要工具。

目前，标记多肽作为定量蛋白质组中的“化学标签”广泛应用于生物示踪与生 物检测等领域。然而，有关于¹⁵N稳定性同位素标记八肽GFL的制备工艺还未见 相关报道。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种工艺合理、产 品纯度高的稳定性同位素¹⁵N标记八肽拟生长因子的制备方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种稳定性同位素¹⁵N标记八肽GFL拟生长因子的制备方法，其特征在于， 该方法采用Fmoc(9-芴甲氧羰酰基)固相肽合成法，以Wang-树脂为载体，以Fmoc 保护的氨基酸为原料，该原料中至少有一个氨基酸为稳定性同位素¹⁵N标记的，以 HBTU(2-(1H-苯并三唑)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐)、HOBt(1-羟 基苯并三唑)和DIEA(N，N-二异丙基乙胺)为缩合试剂，逐一接入氨基酸，氨 基酸接完后经剪切、纯化制得稳定性同位素¹⁵N标记八肽GFL。

所述的方法具体包括以下步骤：

(1)Fmoc-Ile-Wang树脂的制备

1)将1.5mmol/g取代量的Wang-树脂放入干燥的多肽合成管中；

2)用二氯甲烷溶胀10～60min，用水泵抽干溶剂二氯甲烷，换用DMF洗涤5 次，每次用量2～5ml；

3)取2～10eq HBTU，加2～10eq Fmoc-Ile-OH，少量DMF溶解，加5～15eq DIEA， 混匀；

4)将上述溶液加入树脂中，反应1-2小时；

5)DMF 5ml×5min洗涤；

6)用2～10eq苯甲酸酐或醋酸酐加1eq吡啶封闭树脂上未反应的羟基，DMF 作反应溶剂，反应1小时；

7)用DMF、DCM(二氯甲烷)、甲醇或正己烷5ml×5min洗涤，真空干燥， 得到Fmoc-Ile-Wang树脂；

(2)稳定性同位素¹⁵N标记八肽GFL的制备

采用固相多肽合成的方法，从Fmoc-Ile-Wang树脂出发，用多肽合成管制备， 具体如下：

1)将0.1mmolFmoc-Ile-Wang树脂放入干燥的反应器中；

2)用二氯甲烷溶胀10～60min，DMF洗涤5ml×5min；

3)30％哌啶-DMF溶液脱Fmoc，5min×2次，溶液体积为溶胀后树脂体积的 2-3倍；

4)DMF洗涤5ml×5min；

5)取2～5eq HBTU，2～5eq HOBt，2～5eq Fmoc-Arg(Pbf)-OH，少量DMF 溶解，加4～10eq DIEA，混匀；

6)将上述溶液加入树脂中，反应1～2小时；

7)合成完毕，DMF洗涤5ml×5min，30％哌啶-DMF溶液脱Fmoc，5min×2次， 溶液体积为溶胀后树脂体积的2-3倍；

8)用DMF、DCM、甲醇或正己烷洗涤5ml×5min；

9)取2～5eq HBTU，2～5eq HOBt，2～5eq Fmoc-Arg(Pbf)-OH，少量DMF 溶解，加4～10eq DIEA，混匀；

10)将上述溶液加入树脂中，反应1～2小时；

11)合成完毕，DMF洗涤5ml×5min；

12)30％哌啶-DMF溶液脱Fmoc，5min×2次，溶液体积为溶胀后树脂体积的 2-3倍；

13)用DMF、DCM、甲醇或正己烷洗涤5ml×5min；