[发明专利]一种基于微小RNA调控可在肿瘤细胞内特异性增殖的重组腺病毒载体、其构建方法及其用途

说明书

发明领域

本发明一般地涉及重组腺病毒载体。更具体地说，本发明涉及一种基于微小RNA调控可在肿瘤细胞内特异性增殖的重组腺病毒载体、其构建方法及其用途。

背景技术

基因治疗是一种新的治疗手段，可以治疗多种疾病，包括癌症、遗传性疾病、感染性疾病、心血管疾病和自身免疫性疾病。过去几年里，全球基因治疗取得了巨大的进步。截止2008年9月，临床试验总数已达1432项，第一个基因治疗药物-“今又生”已由我国深圳赛百诺公司自主研发，并获准上市(参见数据库http://www.wiley.co.uk/genmed/clinical/)。

腺病毒是目前基因治疗最常用的载体之一，全球近1/4的基因治疗临床试验方案采用腺病毒作为载体。究其原因，主要是腺病毒与其它载体相比，具有如下优势：(1)装载容量较大；(2)感染范围广，转导率较高，可有效转导分裂期和非分裂期细胞；(3)在细胞中以游离状态存在，不整合到靶细胞基因组，不会引起插入突变，无致癌性；(4)滴度高(可以达到10¹²VP/ml)，稳定性好，储藏和运送方便，易于进行规模化生产和运输。

人腺病毒分为A、B、C、D、E、F六个亚属共49个血清型。目前应用于基因治疗的腺病毒载体极大多数采用C亚属的2及5血清型腺病毒。随着腺病毒学、分子生物学等学科的发展，人们已完成了多个腺病毒全部基因组的测序工作，并对其基因的结构及其功能进行了较为详细的研究，能有效地对腺病毒基因进行改造。例如，以组织特异性启动子调控E1A、E1B的表达、缺失E1A的24bp Rb蛋白的结合区、缺失E1B 55KDa、19KDa基因等。改造后的腺病毒能在目标细胞内进行选择性复制增殖，而在正常细胞内这种能力一定程度上得到减弱。

但改造后的腺病毒仍有局限性，以肿瘤基因治疗为例，首先，肿瘤形成的机制非常复杂，异质性非常强，病人与病人之间，肿瘤与肿瘤之间，同一肿瘤不同肿瘤细胞之间均存在明显差异，就端粒酶而言，某一肿瘤病人的肿瘤细胞的端粒酶阳性，这并不意味着该病人的所有肿瘤细胞端粒酶阳性，因此利用某一肿瘤机制而增殖的腺病毒不足以杀灭所有肿瘤细胞。其次，肿瘤组织中的物理因素如纤维化、混入正常细胞以及坏死区域也可能限制腺病毒扩散。再次，某此肿瘤的腺病毒受体(如柯萨奇腺病毒受体)表达不充分限制腺病毒对其感染。第四，病人的免疫反应限制腺病毒增殖和播散。目前，美国ONYX药物公司尝试单独应用E1b 55kDa蛋白缺失型腺病毒(ONYX-015)治疗肿瘤，其临床有效率只有15-20％(Nemunaitis et al.，2000；US 5677178；US 5801029)。

因此，基因治疗领域非常需要可以选择性地在肿瘤细胞中增殖而在正常细胞不增殖的腺病毒载体系统。从而实现更有效，更特异性地在肿瘤细胞中表达外源基因，同时可以实现正常组织的副作用减至最小的目标。

微小RNA(microRNA)是生物体内源的小片段RNA，通过与靶基因成熟mRNA的3’非翻译区中的靶位点核苷酸序列结合，抑制靶基因蛋白的翻译。微小RNA具有高度的组织特异性和时序性，在不同类型的细胞中表达水平差异大。近几年的研究表明，微小RNA的表达失调与肿瘤的发生相关，多个在正常组织细胞中表达的微小RNA在肿瘤细胞中表达缺失或显著下调。

因而可借助微小RNA的调控机制及其在肿瘤组织与正常组织的表达差异，利用在肿瘤细胞中表达缺失或降低而在正常细胞中表达正常的微小RNA调控腺病毒的增殖必需基因的表达，使腺病毒增殖必需基因在正常细胞中不表达，病毒无法复制与增殖，避免对正常细胞的毒性，而在肿瘤细胞中腺病毒增殖必需基因的表达不受影响，能大量增殖与复制，达到治疗目的。

发明概述

本发明提供了一种重组腺病毒载体，其特征在于：在该腺病毒载体的至少一个增殖必需基因的3’非翻译区中至少插入有一个微小RNA靶位点核苷酸序列：所述微小RNA在肿瘤细胞中表达缺失或降低而在正常细胞中表达正常。

在一个实施方案中，所述微小RNA可以选自let-7，miR-15，miR-16，miR-18，miR-29，miR-34，miR-101，miR-127，miR-128，miR-181，miR-223中的至少一种。所述微小RNA优选选自let-7，miR-34和miR-127中的至少一种。