[发明专利]布氏锥虫亮氨酰tRNA合成酶活性的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种药物技术领域的检测方法，具体是一种布氏锥虫亮氨酰tRNA合成酶活性的检测方法。

背景技术

锥虫，原生动物门肉鞭动物亚门动鞭毛纲动体目锥虫科锥虫属，可寄生在脊椎动物、无脊椎动物以及植物宿主体内，引起宿主感染疾病。布氏锥虫(Trypanosoma Brucei)，锥虫属的一种，主要分布在非洲，尤其是撒哈拉沙漠以南地区。经采蝇叮咬而被感染者，会得一种名为“非洲锥虫病”的疾病，又称非洲睡眠病或嗜睡性脑炎。患者初期可能出现发热、皮疹、水肿和淋巴结胀大等症状，其后脑部和脑膜也可能出现炎症。东非锥虫病的病情可以快速恶化，脑部受影响的情况也较西非锥虫病早些。锥虫病晚期时可能会慢慢地出现其它神经系统毛病，昏睡的情况会续渐增加，最终导致昏迷并造成死亡，睡眠病亦因此而命名。目前，还没有一种有效疫苗可预防非洲锥虫病，因此能够筛选出有效抑制锥虫生长的药物成为当务之急。

氨酰tRNA合成酶，是生命进化过程中最早出现的一类蛋白质。氨酰tRNA合成酶催化氨基酸的活化以及转移氨基酸与其相应的tRNA结合，是蛋白质合成过程中的一步关键的反应。氨基酸与相应tRNA的正确结合，可确保功能蛋白质的正确表达，保证了生命体的严谨性和多样性。基于这一特征，全球很多实验室都在针对氨酰tRNA合成酶进行相关抑制剂的设计和筛选。据已有文献报道，现有研究集中在亮氨酰tRNA合成酶(LeuRS)的研究上。如中国科学院上海生命科学院生物化学与细胞研究所王恩多教授领导的课题组，在酵母和人的亮氨酰tRNA合成酶研究方面做了很多工作；美国加州Anacor Pharmaceuticals公司和欧洲分子实验室研究人员描述了一种新成分AN2690，能够通过阻止真菌蛋白合成的亮氨酰tRNA合成酶而消灭真菌，治疗常见的由真菌引起的指甲感染。然而，在锥虫属，这方面工作还是一片空白。

经对现有技术的文献检索发现，Fernando L.Rock等在《Science》(科学)2007年第316卷第22期1759-1761页发表了题为《An antifungal agent inhibitsan aminoacyl-tRNA synthetase by trapping tRNA in the editing site》(一种在编辑位点通过诱捕tRNA抑制氨酰tRNA合成酶的抗真菌药物)一文，文章中提及一种氨酰化测定方法，该方法使用Millipore公司的微孔过滤板装置进行实验操作，只适合于进行大规模药物筛选，并且价格昂贵。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种布氏锥虫亮氨酰tRNA合成酶活性的检测方法。本发明的方法能够进行以布氏锥虫亮氨酰tRNA合成酶为靶标的抗锥虫药物的筛选。本发明尤其适用小量药物筛选，具有操作简便、快速准确、廉价的优点。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明涉及一种布氏锥虫亮氨酰tRNA合成酶活性的检测方法，包括如下步骤：

步骤一，取预反应液，加到含DMSO(二甲基亚砜)的离心管中，水浴；

步骤二，向离心管中加入ATP，使ATP的终浓度为2mM-8mM，混匀，水浴；

步骤三，从水浴后的离心管中取反应液滴加在定性滤纸片上，在三氯乙酸溶液中洗涤定性滤纸片；

步骤四，在酒精中漂洗定性滤纸片；

步骤五，将滤纸片置于红外灯下烘干；

步骤六，闪烁计数仪检测。

步骤一中，所述预反应液，其1000uL预反应液的组分为，250ul摩尔浓度为250mM、pH值为7.8的HEPES-KOH，250ul摩尔浓度为25mM的MgCl₂，250ul摩尔浓度为225mM的KCl，125ul摩尔浓度10mM的DTT，12.5ul质量分数为2％的BSA，25ul质量分数为20mg/ml的tRNA，50ul活性单位为25U的锥虫亮氨酰tRNA合成酶，37.5ul的100μCi/ml的同位素标记的亮氨酸；将上述组分混合即得预反应液。

步骤一和步骤二中，所述水浴具体为，温度为20℃-37℃，时间为5-60分钟。

步骤三中，所述洗涤具体为：先将滤纸片在三氯乙酸溶液中静置5-15分钟，然后摇晃洗涤1-5分钟，完成一次洗涤过程；重复该过程三次，每次均更换三氯乙酸溶液。

步骤三中，所述三氯乙酸溶液，其组分及质量百分数为：三氯乙酸5％-20％，余量为水。