[发明专利]用于检测高危型人乳头瘤病毒的试剂盒及其制备和应用

说明书

技术领域

本发明涉及人乳头瘤病毒(HPV)的诊断试剂，具体涉及一种用于检测高危型人乳头瘤 病毒的试剂盒及其制备和应用。

背景技术

HPV是人乳头瘤病毒的英文缩写，是一组病毒的总称，组成一个科，其病毒形态类似。 目前已经确定的HPV型别大约有80余种，依据不同型别HPV与肿瘤发生的危险性高低分 为低危险型别和高危险型别HPV，高危险型HPV包括HPV16、18、31、33、35、39、45、 51、52、56、58、59、68共13个型别，与宫颈癌及宫颈上皮内高度病变的发生相关。大量 的子宫颈癌病因学研究证实，高危型HPV感染是子宫颈癌发生的必要因素。HPV感染持续 存在最终导致宫颈癌变，故宫颈癌是可预防的特殊癌症。因此，筛查预警HPV对早期发现 宫颈癌极为重要。

HPV不能在体外培养，所以对它的检测严格依赖于其DNA序列分子水平的检查，目 前对HPV的检测诊断方法主要有以下几种：

(一)子宫颈细胞抹片及ELISA法

子宫颈细胞抹片检查是传统的HPV检测方法，但其假阴性率高，可达20％～30％。 ELISA方法是另一种传统检测方法，由于制备相应型的单抗工作繁琐，只能用于个别亚型 的鉴定，到目前为止，此方法已逐渐被取代。

(二)杂交捕获检测法

美国Digene公司的HC-II杂交捕获法检测方法，可以检测高、低危群体的HPV病毒， 但这种分类试剂盒，假阳性率高(50％～60％)、特异性低(37％～64％)、且费用昂贵，未能 达到一般用家的要求。

(三)PCR检测法

与传统的细胞抹片检查相比，PCR检测灵敏度高，可检测极微量的HPV DNA。但是 由于涉及多次扩增，容易有交替污染，以至假阳性率偏高。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测高危型人乳头瘤病毒的试剂盒及其制备和应用。

本发明的技术原理如下：

TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭剂则在3’ 末端。当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭。在 进行延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭剂分离，发射 荧光。一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加，释 放出来的荧光基团不断积累。本发明采用Taqman荧光定量PCR原理，设计针对HPV核酸 序列型特异性引物，扩增HPV型特异性核酸序列，同时设计Taqman探针，针对HPV型特异 性序列，位于上下游引物之间。针对HPV序列的探针其5’端标记荧光报告基团，3’端标 记非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher)。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧 光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇 到与模板结合的探针，其5′→3′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团， 其能量不能被吸收，即产生荧光信号。

基于上述原理，本发明第一方面提供了一种用于检测高危型人乳头瘤病毒(HPV)的试 剂盒，包括：高危型HPV核酸荧光PCR检测混合液；其中，高危型HPV核酸荧光PCR检测 混合液是指：含有高危型人乳头瘤病毒的上游引物、下游引物、探针、PCR-MIX和H₂O的混 合溶液。其中，高危型人乳头瘤病毒特异性引物与特异性探针的浓度可由本领域技术人员 根据PCR技术所需的常规条件来确定。

所述PCR-MIX为含有PCR扩增缓冲液、Mg2+和dNTP的混合溶液，可以由Linktech购 得，也可自行配制。

所述高危型人乳头瘤病毒包括：HPV16型人乳头瘤病毒、HPV 18型人乳头瘤病毒、 HPV 31型人乳头瘤病毒、HPV 33型人乳头瘤病毒、HPV 35型人乳头瘤病毒、HPV 39型 人乳头瘤病毒、HPV 45型人乳头瘤病毒、HPV 51型人乳头瘤病毒、HPV 52型人乳头瘤病 毒、HPV 56型人乳头瘤病毒、HPV 58型人乳头瘤病毒、HPV 59型人乳头瘤病毒和HPV 68 型人乳头瘤病毒。