[发明专利]一种以固体秸秆为碳源培养发酵种子液的方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及发酵与生物质能源技术领域，具体地说，是一种以固体秸秆 为碳源培养发酵种子液的方法。

【背景技术】

农作物秸秆等纤维质原料是世界上最丰富的可再生资源，利用纤维质原 料发酵生产酒精，用于车用燃料乙醇是一个极具前景的产业。秸秆作为一种 丰富的农业副产物，成本低廉，分布广泛，以它作为原料能够降低生物乙醇 的原料成本，扩大乙醇生产规模。

纤维质原料发酵生产乙醇一般包括原料的预处理、酶水解、发酵、提纯 等步骤。现有主要的预处理方法包括稀酸预处理和蒸汽汽爆等技术，原料预 处理能够破坏纤维质原料对酶解过程的抵抗性，有利于酶水解的进行，但是 预处理过程会产生大量的抑制物，这些抑制物抑制了发酵微生物在纤维质原 料水解液中的生长以及乙醇发酵。为了能够有效的进行秸秆乙醇发酵，研究 者首先提出通过脱除水解液中抑制物的方式来提高发酵效率，包括碱中和、 离子交换、溶剂萃取等方法，这些方法使得过程成本提高，操作复杂，也加 大后续乙醇分离的难度。另一种途径即把发酵微生物培养在含纤维素水解液 清液的培养基中，进行驯化培养，使菌种具备对抑制物的耐受性，再用于乙 醇的同步糖化发酵。但是，无论水解液的脱毒处理或菌种的驯化培养，都需 要液固分离设备，这不仅增加设备成本，在液固分离和脱毒过程都会导致可 发酵糖的损失，此外也增大染菌的风险。这就需要一种能够实现低成本培养 乙醇发酵种子液的方法，在工艺上简单可行，同时也能够起到驯化发酵微生 物的目的。

【发明内容】

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种以固体秸秆为碳源培 养发酵种子液的方法。

本发明的构思：以固体秸秆类物质为原料发酵生产燃料乙醇过程中种子 培养液的低成本培养方法，适合于以固体秸秆类物质为原料进行乙醇发酵或 其它生物基产品发酵的工业发酵菌种种子培养，菌种在多级培养过程中，向 培养基中添加预处理后的固体秸秆作为碳源，同时加入纤维素酶和营养盐， 使种子在培养阶段即采用同步糖化与发酵的方式生长。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种以固体秸秆为碳源培养发酵种子液的方法，其具体步骤为：

(1)发酵菌种的活化：

从菌种保藏平板、保藏斜面或冷冻甘油保藏管保存的菌种接种于合成培 养基，培养温度25～45℃，优选温度为30℃；转速50～500rpm，优选转速 为150rpm；培养12～36小时，OD₆₀₀值达到4～16；

在合成培养基中，葡萄糖浓度10～100g/L，营养盐浓度是KH₂PO₄或 K₂HPO₄ 0.5～10g/l，MgSO₄·7H₂O 0.1～5g/l，(NH₄)₂SO₄ 0.5～10g/l，酵母萃 取粉或玉米浆0.1～10g/l；

所述的菌种包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、管囊酵母 (Pachysolen tannophilus)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、克鲁维酵母 (Kluyveromyces marxianus)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)菌株， 以及通过诱变、基因工程等操作改造上述菌株以及上述菌株的两种或数种的 混合发酵；优选为酿酒酵母；其中：诱变筛选的菌株是指通过化学、物理以 及射线等诱变改造的菌株；基因工程操作的菌株是指通过转入质粒、同源重 组及改善代谢路径后的可用于代谢六碳糖或五碳糖发酵生产乙醇的菌株；

OD₆₀₀值是指含有菌体的溶液在600nm波长处的吸光值；

(2)培养基中添加预处理的固体秸秆进行同步糖化驯化培养种子：

活化的种子液的体积百分数为5～20％接种于固体秸秆的混合培养基中， 在混合培养基中固体秸秆的质量百分数为3～30％，加入纤维素酶和营养盐， 转速50～500rpm，温度25～45℃，培养12～36小时；优选条件为转速150rpm， 温度37℃，培养18小时；得到发酵菌种的浆液；

混合培养基是指以0.1～50g/L葡萄糖溶液调整固体秸秆固含量的培养基， 其pH为2.0～8.0，优选pH为5.0；